פרוטוקול זה מציג תובנה על פריחת האצות וכיצד לפקח על מינים אצות רעילים ביעילות. ההליך מסייע לספק אזהרה מוקדמת על פריחת אצות כדי להגן על הקהילה מפני נזקים נלווים. ניתוח Metabarcoding יכול לזהות מינים רבים במדגם בבת אחת, אבל זה דורש הליכים מסובכים.
פרוטוקול זה מסביר חזותית כל שלב כדי לסייע במזעור טעויות אנוש במהלך הניתוח. את הליכי המיקרוסקופיה מדגים הנרי קמרון מאוניברסיטת אנטופגסטה, איסוף דוגמאות מאת ג'ונתן וילוגרון ממכון פומנטו פסקרו, טיפול מקדים לדוגמה של קארן ורגרה מאוניברסיטת לוס לאגוס, וניתוח המטא-ברקודינג של איגנסיו רילינג ומרקו קמפוס מאוניברסיטת לה פרונטרה. התחל על ידי איסוף שלושה ליטרים של דגימת מים מנקודת יעד.
סנן ליטר אחד של המים לניתוח 16S rRNA באמצעות סינון דו-מושבי כדי להפריד את החיידקים החיים החופשיים המחוברים. לאחר מכן, לסנן עוד ליטר אחד של מים לניתוח 18S rRNA באמצעות סינון יחיד עם קרום 0.2 מיקרון. לאחר מכן, באמצעות מספריים כירורגיים סטריליים, לחתוך את הממברנה המסוננת לשניים, לעטוף חצי אחד עם רדיד אלומיניום לאחסון, ועם החצי השני להמשיך מיצוי DNA עם שיטת Chelex.
לניתוח מיקרוסקופי, העבר מיליליטר אחד של דגימת המים למגלשת רשת של מיליליטר אחת באמצעות פיפטה. התבונן במדגם תחת מיקרוסקופ ותיעד את השמות והכמות של מיני פיטופלנקטון. פיפטות נקיות בארון מכסה המנוע למינאר עם 70%אתנול, ואחריו חשיפה לקרינת UV במשך 30 דקות.
עבור הדור הראשון של אמפלייקון PCR, aliquot 22.5 microliters של תערובת מאסטר ברצועת צינור שמונה ואחריו 2.5 microliters של דגימת ה- DNA, ולאחר מכן להפעיל את מחזור PCR הראשון. לאחר מכן, להכין 100 מיליליטר של 2% agarose TBE ג'ל המכיל 10 microliters של כתם ג'ל חומצה גרעין. לאחר שהג'ל מוכן, לטעון תערובת המכילה 1.5 microliters של צבע טעינת DNA וארבע microliters של המוצר PCR ולבצע אלקטרופורזה ב 100 וולט במשך 30 דקות.
לאחר מכן, תמונה הג'ל תחת אור UV ולאשר את נוכחותו של 500 עד 600 רצועת זוג בסיס. אמפליקונים חסרים לפעמים ניתן לפתור על ידי דילול המדגם ל 1, 000 פי שלושה עם מים. לאחר מכן, השתמש במערכת ניקוי DNA מבוססת חרוזים מגנטיים כדי לנקות את מוצרי ה- PCR הראשונים, ולאחר מכן העבר 20 מיקרוליטרים של כל מוצר PCR ראשון ניקה לצלחת חדשה 96 באר ולאטום את הצלחת עם סרט Microseal.
לאחסן את הצלחת במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשלב הבא. עבור אינדקס על ידי PCR שני, לאחר דילול כל האינדקס הראשון ומדד שני פריימרים לריכוז מיקרומולרי אחד עם מים כיתה PCR בשמונה רצועות PCR צינור, למקם את האינדקס פריימרים אחד בשורה אופקית אינדקס שני פריימרים בשורה אנכית. לאחר מכן, באמצעות פיפטה רב ערוצית ב 2.5 microliters של אינדקס פריימר אחד לכל באר של צלחת חדשה 96 באר.
לאחר מכן, הוסיפו 12.5 מיקרוליטרים של ניסוח מוכן להתחלה חמה לכל באר. לאחר מכן, הוסף 2.5 מיקרוליטרים של אינדקס שני פריימר ו 7.5 מיקרוליטרים של מוצר PCR הראשון המטוהר לכל באר. לאחר ערבוב על ידי צנרת למעלה ולמטה 10 פעמים, לכסות את הצלחת עם סרט Microseal ולהפעיל את מחזור PCR השני.
לאחר השלמת ה- PCR, מקם את קלטת מסך ה- DNA במנתח שברים. מערבבים שני מיקרוליטרים של מאגר מדגם בשלושה מיקרוליטרים של אמפלייקון PCR השני בשמונה רצועות צינור חדשות ולהכניס את הרצועות לתוך מנתח שברים כדי להתחיל את הניתוח. ודא כי אמפליקולי PCR השניים הם כ-613 זוגות בסיסים הן עבור גנים של 16S והן עבור 18S rRNA.
טהרו את מוצרי ה-PCR השניים באמצעות מערכת ניקוי DNA של חרוזים מגנטיים, כפי שהודגם בעבר. ואז למדוד את ריכוז ה- DNA שלהם באמצעות ספקטרופוטומטר כימות חומצת גרעין. בצלחת חדשה של 200 מיקרוליטר 96-באר, לדלל כל מוצר PCR שני מטוהר עם מי PCR סטריליים לארבעה ננומולים.
בשלב הבא הלאה, יש לבצע את הפרוטוקול ללא עצירה. Aliquot שלושה microliters של כל מוצר PCR השני מדולל בצינור סטרילי חדש 1.5 מיליליטר כדי ליצור ספרייה מפולגת. תמיד לשמור על הצינור בארבע מעלות צלזיוס.
יום לפני הרצף, הסר מחסנית ריאגנט מוכנה לשימוש ממולאת מראש ממינוס 20 מעלות צלזיוס והצב אותה בארבע מעלות צלזיוס להפשרה. ביום הרצף, קבע בלוק חום המתאים לצינורות צנטריפוגות 1.5 מיליליטר ל -96 מעלות צלזיוס והניח את חיץ ההכלאה על קרח. לאחר מכן, לדלל נתרן הידרוקסיד ברמה מולקולרית עם מים לדלל ספריית בקרה מוכנה לשימוש עם מאגר TE.
מערבבים 16 מיקרוליטרים של ארבע ספריית ננומול או מדגם מאוחסן עם ארבעה מיקרוליטרים של ספריית הבקרה בצינור חדש המסומן כאחד. לאחר מכן, לערבב 10 microliters של המדגם מצינור אחד עם 10 microliters של נתרן הידרוקסיד בצינור חדש שכותרתו שניים. לאחר מערבולת וסיבוב קצר, צינור דגירה שתיים בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות, ולאחר מכן להוסיף 980 microliters של חוצץ הכלאה.
לאחר מכן, בצינור חדש שכותרתו שלוש, לערבב 260 microliters של המדגם מצינור שני עם 390 microliters של חוצץ הכלאה. לאחר ערבוב התוכן על ידי היפוך הצינור, לדגור אותו ב 96 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות, ואחריו דגירה על קרח במשך שתי דקות. לאחר מכן, הסר את המחסנית מהמקרר והגדר את גיליון הדגימה לרצף עם כל אינדקס מתאים אחד ואינדקס שני מתאמים.
לאחר הסרת תא הזרימה מערכת MiSeq V3, נקה בעדינות את תא הזרימה עם מי PCR סטריליים ברמה מולקולרית. טען את כל הנפח של צינור שלוש לתוך המחסנית. לאחר מכן, בתוכנת פעולת המכשיר, בחר רצף ובצע את ההוראות להכנסת תא זרימה, מאגר התאגדות ומחסנית.
לבסוף, טען את גיליון המדגם ולחץ על הפעל כדי להתחיל את התגובה. ריצת רצף זו אורכת שלושה עד חמישה ימים. ניתוח מטא-בר-ריאה של 18S rRNA לזיהוי מינים אצות הנמצאים במי ים שנאספו ממטרי פוארטו מונט, צ'ילה ב-19 בפברואר 2019, הניבו 13,750 קריאות, עם יותר מ-30 מינים של אצות.
מין נאביקולה היה האלגו הדומיננטי עם שפע יחסי של 70.73%כמו כן, שפע מספיק נצפה עבור מיקרומונים, צ'אטוקורוס, סקריפסילה ו- Prorocentrum מינים. מינים פסאודוצ'אטלונלה, אחד הסיבתיים העיקריים של פריחת אצות מזיקות צ'יליאני, יש שפע 0.52%. בהתאם לניתוח הגנים rRNA 18S, תצפית מיקרוסקופית הראתה Navicula כדומיננטי Prorocentrum כמין קטין.
12.6% מתאי פיטופלנקטון קטנים ובלתי מזוהים שנרשמו על ידי מיקרוסקופיה יכולים להיות מיקרומונים, על פי תוצאות 18S rRNA. ניתוח מטא-ברקודציה של 16S rRNA לזיהוי מינים חיידקיים באותה דגימת מים הראה 31, 758 קריאות עם יותר מ-30 מינים חיידקיים. המין החיידקי החי החופשי הדומיננטי היה Amylibacter, עם שפע יחסי של 20.02%ואחריו קלדלה עם 13.53% ואלג'פילוס ב -7.06%השפע היחסי של שני מינים אצות רעילים, אלכסנדריום ופסאודוצ'אטונלה, זומם בזמן לגרום למצוא דפוס צמיחה ייחודי.
השפע היחסי של כל הסוג החיידקי בסדרים שזוהו ממי הים במשך חמישה חודשים מתווה וזמן נגרם כדי לנתח את שינוי האוכלוסייה של אורגניזמים מסוימים. זה חיוני כדי להיות נקי במיוחד. יש להימנע מזיהום מדגם באמצעות ניגוב אלכוהול, אור UV או autoclaving החומר.
אין לעשות שימוש חוזר בפתרונות מדוללים ויש תמיד לכתר את הצינורות. זיהוי אצות על ידי metabarcoding חייב להיות מזווג עם מיקרוסקופיה. המין הדומיננטי יכול להיות מאושר על ידי מיקרוסקופיה המבטיחה לא טעות אנוש במהלך תהליכי metabarcoding.
פריחת אצות מזיקה פוגעת במערכת האקולוגית הימית ובכלכלת החוף. בצ'ילה, פריחות אצות הורגות סלמון חקלאי, ומזיקות לאגאה-חקלאות. ניתוח מטא-ברקוד זה יגביר את היעילות של אזהרות פריחה בצ'ילה.
