השיטה לבידוד פטריות אנטומופתוגניות חשובה לפיתוח סוכני בקרה מיקרוביאלית. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבודד ולבחור מבודד פטרייתי virulence גבוה מדגימות הקרקע. טכניקה זו כוללת שלושה שלבים של הקרנת פתוגניות ומשלבת את בדיקת ייצור התרמו-טרודניות והקונידיה כדי להפוך את דירוג מספר הקונידיה היעיל.
השיטה יכולה לעזור לבחור עוצמה גבוהה ומבטיח entomopathogenic מבודד פטרייתי חדש למסחור. פרוטוקול זה מתמקד בשליטה ביולוגית, זה יכול לשמש גם כדי לגלות את מבודד פטריות entomopathogenic כדי ללמוד את האינטראקציה בין מזיקים ופטריות אנטומופתוגני. מדגים את ההליך יהיה יאו-צ'יה ליו וניאן-טונג ני, סטודנט אמן מהמעבדה שלי.
התחל עם איסוף דגימת הקרקע על ידי הסרת סנטימטר אחד של אדמת פני השטח ולאחר מכן איסוף הקרקע בתוך עומק 5 עד 10 ס"מ מכל אתר דגימה באמצעות את חפירה. לאחר רישום הפרטים של כל אתר דגימה, לאסוף ולשמור 100 גרם של דגימת קרקע לתוך שקית ניילון בטמפרטורת החדר כדי לבצע את פרוטוקול בידוד פטרייתי בתוך שלוש שעות. כדי לבודד את הפטריות האנטומופתוגניות הפוטנציאליות, או EPF, להוסיף 100 גרם של דגימת הקרקע בכוס פלסטיק ולהניח חמש תולעי מוליטור טנבריו על פני השטח של האדמה בטמפרטורת החדר בחושך במשך שבועיים עם התבוננות ותיעוד תמותת הזחלים mycosis מדי יום.
שמור את הזחל המת בכוס עד שבועיים לבידוד פטרייתי. לאחר שבועיים, להעביר את החרקים המתים לספסל נקי ולהשתמש קיסם סטרילי כדי לאסוף את conidia. כדי להשיג את התרבות העיקרית של פטריות, פס conidia שנאסף על רבע כוח Sabouraud דקסטרוז אגר מדיום או SDA בצלחת 55 מילימטר לדגור ב 25 מעלות צלזיוס במשך שבעה ימים.
ביום השמיני, יש להחזיר כל פטריית תרבות ראשונית על צלחת SDA אחת 55 מ"מ בעוצמה רבע במכסה המנוע של זרימה למינאר לפני הדגירה התרבות ב 25 מעלות צלזיוס במשך שבעה ימים כדי להשיג מושבות בודדות של פטריות. בהקרנת הפתוגניות הראשונה, הנח חמישה זחלי מוליטור טנבריו ישירות על פני השטח של כל צלחת תרבות פטרייתית טהורה ב -25 מעלות צלזיוס. לאחר התבוננות ותיעוד של מיקוסיס ותמותה במשך 10 ימים, בחר את מבודד פטרייתי לניתוח נוסף.
כדי לבצע את בדיקת virulence השני, לקצור את conidia של כל בידוד פטרייתי על ידי מערבולת במשך דקה אחת ולספור את מספר conidia באמצעות hemocytometer. כאשר נעשה, להתאים את השעיית conidia לריכוז של פעם אחת 10 כדי 1/7 conidia למיליליטר בתמיסה 0.03%פעילי שטח לפני הפצת 10 microliters של השעיה פטרייתית על צלחת SDA 55 מ"מ כוח רבע כוח לגדול במשך שבעה ימים ב 25 מעלות צלזיוס בחושך. ביום השמיני, הניחו חמישה זחלי מוליטור של טנבריו ישירות על פני השטח של כל צלחת תרבות פטרייתית טהורה וחתמו את הצלחות עם סרט Parafilm כדי לדגור תוך התבוננות במיקוזיס ובתמותה כפי שתואר קודם.
לאחר החזרה על בדיקת הוולולנס השנייה בשלישייה עבור כל בידוד פטרייתי, בחר את המבודדים כדי לבצע בדיקת ארס שלישית למזיק היעד כמו Spodoptera litura. לאסוף כ-EPF מילימטר מרובע אחד מצלחת SDA בת שבעת הימים כדי לחלץ את הדנ"א הגנומי הפטרייתי באמצעות ערכת מיצוי דנ"א גנומית פטרייתית. לאחר מכן, להגביר את מרווח מתמלל פנימי פטרייתי או אזור ITS על ידי PCR של דגימת ה- DNA בעקבות תוכנית PCR המתוארת בכתב היד של הטקסט.
לאחר ריצוף המוצר המוגבר PCR על ידי שירות רצף מסחרי, להשתמש NCBI BLAST כדי לחפש פטריות דומות במסד הנתונים NCBI ולבחור את המינים הפטרייתיים היחסי לניתוח פילוגנטי. יישר את הרצפים המרובים וחתוך את אזור הרצף השמור באופן ידני עם GeneDoc. בצע את הניתוח הפילוגנטי בהתבסס על האבולוציה המינימלית, הצטרפות השכנים, ושיטות הסבירות המרבית.
כדי ללמוד את המורפולוגיה של הפטריות, ללכוד את צמיחת מושבת התרבות הפטרייתית במשך שבעה ימים עם מצלמה ולתעד את הצמיחה, את הצורה: רכה או מוצקה, וצבע המושבות. כדי לצפות בקונדיה בקונדיופורים, לגרד conidia מן המושבה פטרייתית תרבות טהורה עם לולאת חיסון ולהעביר את הנבגים לשקופית זכוכית המכילה 0.1%Tween 80 פתרון. השתמש באזמל כדי לחתוך בלוק אגר של המושבה הפטרייתית ולאחר מכן להעביר את בלוק אגר למגלשת זכוכית ולהוסיף את הפתרון 0.1%Tween 80 לשטוף את רוב conidia עודף על אגר.
לאחר מכן, לכסות את השקופית עם פתק כיסוי עבור תצפית מיקרוסקופית קלה של conidia. למדוד ולתעד את הרוחב והאורך של conidia ו conidiophores כדי להשוות את ההבדל בין מבודד פטרייתי שונים. ארגן בדיקת ייצור חדורית על ידי פולחן של הבידוד הפטרייתי שנבחר על מדיום SDA בעוצמה של כ-25 מעלות צלזיוס בחושך למשך 10 ימים.
לאחר מכן להכין השעיה קונדיאלית אחת מיליליטר של בידוד פטרייתי ב 0.03%פתרון פעילי שטח ואחריו התאמת הריכוז פעם אחת 10 ל 1/7 conidia למיליליטר כפי שתואר קודם לכן. לאחר הוספת שלוש טיפות של 10 microliters של השעיה conidial על צלחת SDA כוח רבע, לדגור על התרבות ב 25 מעלות צלזיוס בחושך במשך שבעה, 10, ו 14 ימים לספור את הניבוי של פטריות. בכל נקודת זמן, לנתק בלוק אגר חמישה מילימטר ממרכז המושבה עם בולע שעם ולהעביר את הבלוק לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של 0.03% פתרון פעילי שטח.
לאחר מערבולת הצינור ב 3, 000 סיבובים לדקה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות, להשתמש hemocytometer כדי לספור את מספר conidia. לבדיקת התרמוטולנס, תרבות לבודד פטרייתי נבחר ולהכין פעם אחת 10 כדי 1/7 conidia לכל השעיה מיליליטר כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מערבולת, לחמם את ההשעיה conidial באמבטיה יבשה ב 45 מעלות צלזיוס עבור מרווחי זמן שונים.
לאחר חשיפה לחום, להוסיף שלוש טיפות של חמישה microliters של השעיה conidial על צלחת SDA רבע 55 מ"מ כוח בכל נקודת זמן ולאחר מכן לדגור על הצלחות בסביבות 25 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות. כדי לקבוע את קצב הנביטה, לספור את מספר נבגי conidia נבט עם חמישה שדות שנבחרו באקראי תחת מיקרוסקופ האור בהגדלה של פי 200. חשב את מספר הקונידיה האפקטיבי הכולל או ECN באמצעות הנוסחה, ולאחר מכן חשב ניתוח רכיבים עקרוניים או PCA של זנים פטרייתיים כמתואר בכתב היד.
בחר את הזנים הפטרייתיים בעלי הביצועים הטובים ביותר בהתבסס על ECN או PCA כדי לבצע את בדיקת virulence של מזיקי יעד. במבחן הארס השני, הוערך הארסיות של 26 המבודדים הפטרייתיים נגד תולעי הארוחה של טבריו מוליטור. 12 מבודדים פטרייתיים עם פתוגניות גבוהה נבחרו לבדיקת virulence נגד Spodoptera ליטורה.
כדי להבין טוב יותר את התנוחות טקסונומיות פטרייתיות, 26 מבודדים מהקרנת הפתוגניות הראשונה היו נתונים לניתוח מולקולרי המבוסס על אזור ITS. באמצעות שיטת הניקוי של תצפיות מורפולוגיות פטריות, המבנים של conidiophores ניתן לראות בבירור עם 0.1% Tween 80 פתרון. צבעה, צורתה וסידור הקונידיה של הקונידיה נחקרו באמצעות תצפיות מיקרוסקופיות של מושבת הקונידיה.
ה- ECN משלב נתוני ייצור קונידיה ותרמוטולנס של כל EPF. הכדאיות הגבוהה של זן פטרייתי נצפתה כאשר ערך ECN היה גבוה. כמו כן, התגלה תיאום גדול בין ה- PCA לבין ה- ECN, דבר המצביע על כך שניתן להשתמש ב- ECN כדי להעריך את ההיררכיה של פרמטרים הקשורים ערך.
הקרנת הפתוגניות המחלצת את הדנ"א הפטרייתי ופולחן את הבידוד הפטרייתי חשובים בהליך. באמצעות נוסחת חישוב ECN, ניתן לבחור את הפטריות הפאתוגניות הפנימיות האידיאליות. שילוב של מיני חרקים שונים, כגון עש שעווה גדול יותר ותולעי ארוחה יחד כדי לפתות את הפטריות entomopathogenic מן דגימות הקרקע עשוי להגדיל את המגוון של פטריות אנטומופתוגני.
מגוון המיקרואורגניזם של האדמה הוא נושא מעניין מאוד במהלך הפעלת פרוטוקול זה. זה יכול להיחקר גם בעתיד באמצעות פרוטוקול זה.
