וירוס הרפס סימפלקס oncolytic הוא צורה המתעוררים של אימונותרפיה סרטן. מערכת יעילה של התפשטות וירוסים, טיהור ונחישות טיטרית היא קריטית לשימוש במחקרים ניסיוניים. שיטה זו היא פשוטה מאוד וניתן לאמץ בקלות בכל biosafety רמה שתיים הגדרת מעבדה כדי לקבל מלאי ויראלי באיכות גבוהה למחקרים פרה-קוליניים.
ייצור של איכות גבוהה, מלאי ויראלי טהור הוא חיוני שכן הוא משמש לחקר התגובה החיסונית נגד סרטן ולפתח צורה חדשה של אימונותרפיה סרטן מבוסס וירוס. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לטהר כל וירוס הרפס סימפלקס מסוג פראי או מהונדס גנטית. פרוטוקול זה צריך להיות קל לקריאה וקל לעקוב אחר אדם שמעולם לא ביצע טכניקה זו לפני.
החומרים הרשומים ריאגנטים צריך להיות במקום לפני שניסה טכניקה זו בפעם הראשונה. התחילו בשטיפת צלושי T-150 ס"מ רבועים עם DPBS גלוקוז גבוה פי שניים בתוספת 1%IFCS. לשאוף את DPBS ולהוסיף שבעה מיליליטר של אינוקולום וירוס לכל בקבוק.
בעדינות לנענע את הבקבוקים במשך חמש דקות דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1.5 עד 2 שעות. לאחר מכן, להסיר את inoculum ולהוסיף 25 מיליליטר של DMEM בתוספת 1%IFCS לכל בקבוק. לאחר הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך יומיים עד ארבעה ימים, לאסוף 20 מיליליטר של התרבות supernatant מכל בקבוק לתוך צינורות צנטריפוגה 50 מיליליטר.
באמצעות מגרד תאים, לגרד את התאים מתחתית הבקבוקים. הוסף כ 15 מיליליטר של תרבות שנאסף בעבר supernatant לכל בקבוקון כדי להביא את הנפח עד 20 מיליליטר, ולאחר מכן להשתמש פיפטה סרולוגית סטרילית 10 מיליליטר לשטוף בעדינות את החלק התחתון של הבקבוקים כמה פעמים. לאסוף את התאים עם בינוני לתוך צינורות צנטריפוגה חרוט 50 מיליליטר להציב על קרח.
צנטריפוגה הצינורות ב 300 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. Resuspend כל גלולה ביסודיות 1.25 מיליליטר של מאגר וירוסים, או VB, ו 1.25 מיליליטר של תרבות שנאספו בעבר supernatant. מערבבים את כל כדורי resuspended לתוך צינור אחד צנטריפוגה חרוט 50 מיליליטר.
הצמד להקפיא את התאים בשימוש חוזר באמצעות קרח יבש ו 100% אתנול ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. להפשיר את התאים הקפואים שנשברו בעבר באמבט מים חמים ב 37 מעלות צלזיוס sonicate במשך דקה אחת במשך שלושה מחזורים באמבט מים. הוסף 175 יחידות של נוקליאז בנזונס ושני מיקרוליטרים של שני מגנזיום כלוריד מילימולאר למיליליטר של ליסט התא ומערבולת.
לאחר דגירה של 30 דקות ואמבט מים חמים ב 37 מעלות צלזיוס, מניחים את הצינור על קרח. לסובב את התא lysate ב 300 פעמים G במשך 10 דקות. לאסוף את supernatant בצינור צנטריפוגה חרוט 50 מיליליטר חדש resuspend גלולת התא ב 500 microliters של VB. לייעד אותו ככדור אחד.
סובב את supernatant שנאסף שוב ב 500 פעמים G במשך 10 דקות ולאחסן את supernatant בנפרד בצינור צנטריפוגה חרוט טרי 50 מיליליטר לשימוש מאוחר יותר. Resuspend גלולת התא ב 500 microliters של VB, ייעוד זה כמו גלולה שתיים. לשלב את גלולה resuspended אחד גלולה שתיים בצינור צנטריפוגה חדש 1.75 מיליליטר ומערבולת sonicate פעמיים באמבט מים לפני ספינינג הצינורות ב 400 פעמים G במשך 10 דקות.
לאסוף את supernatant מצינור צנטריפוגה 1.7 מיליליטר ולשלב אותו עם supernatant שנאסף בעבר צינור צנטריפוגה חרוט 50 מיליליטר. לסנן את supernatant דרך מסנן קרום PVDF סטרילי חמישה מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר חדש שנקרא צינור אחד. הוסף מיליליטר אחד של VB לצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר, התרוקן לאחר סינון supernatant מהצעד הקודם, מערבולת, ולהעביר אותו דרך אותו מסנן קרום PVDF להציב על צינור אחד.
להעביר את הסינון מצינור אחד דרך מסנן קרום MCE סטרילי 0.8 מיקרומטר ממוקם על צינור צנטריפוגה חדש 50 מיליליטר בשם צינור שתיים. הוסף מיליליטר אחד של VB לצינור מרוקן אחד, מערבולת, ולהעביר אותו דרך אותו מסנן MCE ממוקם על צינור 2. מעבירים את הסינון מצינור 2 דרך מסנן PVDF סטרילי של 0.45 מיקרומטר שהונח על צינור צנטריפוגה חדש של 50 מיליליטר עם תווית צינור שלוש.
כפי שתואר קודם לכן, לחזור על שטיפת צינור 2 עם מיליליטר אחד של VB להוסיף סינון צינור שלוש. בניתוח מייצג זה, ניתן היה לראות את האפקט הציטופתי בתאי Vero ב 36, 48, ו 72 שעות לאחר זיהום oHSV עם עיגול של התאים המושפעים. הרמה ההולכת וגדלה של CPE לאורך זמן ניכרת כפי שהיא מוצגת על-ידי ביטוי mCherry.
ב 72 שעות לאחר ההדבקה, לוחות ויראליים היו מוכתמים X-גל לדמיין oHSVs עם ביטוי lacZ. קרצוף בעדינות את התאים נגועים בווירוס בעדינות לשטוף את החלק התחתון על הבקבוק הוא קריטי כדי לשמור על כל התא הנגוע HSV שלם, כך מלאי נגיפי טיטר גבוה ניתן להשיג.
