המטרה הכללית של הניסוי הייתה לזהות שברי דנ"א הקשורים לחלבון ברחבי הגנום, ששיקפו את מצב הכרומטין. כדי להשיג מטרה זו, בוצעו שלושה מבצעים מיוחדים. קודם כל, הגרעינים השלמים מתאי הצמח היו מבודדים.
שנית, שינויים בכרומטין זוהו על ידי נוגדן מסוים במקום. שלישית, הנוגדן הקושר חלבון A-transposase היתוך חלבון, Tn5 transposase, לבקע את הכרומטין במקום תחת ההפעלה של יוני מגנזיום. שברי הדנ"א ואתרי איגוד שינוי הכרומטין שולבו אז עם מתאמים והוכנו להכנת DNA.
העשרת תגובת שרשרת פולימראז שיפור רצף הדור. רגולציה אפיגנומיקה ברמה הכרומטית, כולל שינויי DNA והיסטון, התנהגויות של גורמי שעתוק, ו- RNAs שאינם מקודדים עם החלבונים המגויסים שלהם, מובילים לשליטה זמנית ומרחבית בביטוי הגנים. טכנולוגיית CUT&Tag שפותחה על ידי מעבדת Henikoff היא שיטת קשירת אנזימים ליצירת פרופיל אפיגנומיקה של כרומטין ביעילות גבוהה.
כאן אנו מעסיקים את עלי הכותנה כחומרים ניסיוניים, וכדי לבצע את פרופיל הכרומטין באמצעות נוגדן של Histone H3 ליזין-4 טרימתילציה כדוגמה. אנו מספקים פרוטוקול מעודן עם וידאו לביצועי CUT&Tag בצמחים. עבור כל הכנת מדגם באמצעות CUT&Tag, נאסף גרם של רקמת עלה כותנה.
העלה נטחן לאבקה עדינה עם חנקן נוזלי, והועבר לצינור בז 50 מ"ל המכיל 25 מ"ל של חיץ בידוד גרעיני צונן A.פתרון החיץ היה מעורבב בעדינות, ואת הצינור היה דגירה על קרח במשך חמש דקות עם רועד עדין כדי לפזר את החומר באופן שווה. לאחר מכן הוא סובב ב 500 כוח צנטריפוגלי יחסית או rcf, ב 4 מעלות צלזיוס, במשך חמש דקות, כדי ליצור את גלולה התא. הסופר-ננטנט ננטש והכדור הוחזר עם 20 מ"ל של חיץ בידוד גרעיני צונן B, בתוספת 0.5% טריטון.
הצינור היה הפוך בעדינות כדי resuspend הכדור לחלוטין. lysate התא שנוצר לאחר מכן היה מסונן עם שילוב של שני מסננים, מסננת 500-רשת שימשה על גבי כדי להסיר את פסולת הרקמה הגדולה יותר. ומסננת של 1000 רשת שימשה בתחתית כדי לאסוף את הגרעינים.
הבחירה בגודל הרשת המתאים של המסננות תלויה בגודל הגרעינים של הצמחים. נייר סינון סטרילי שימש בצד האחורי של המסננת כדי לספוג חלק של lysate ופסולת תאים קטנים. הליסט המכיל את הגרעינים הועבר לצינור צנטריפוגה טרי של 1.5 מיליליטר, וסובב ב-300 RCF במשך ארבע דקות, ב-4 מעלות צלזיוס מעלות צלזיוס כדי לאסוף את הגרעינים.
לאחר צנטריפוגה, קצה פיפטה שימש כדי להסיר כמה שיותר של supernatant ככל האפשר. כמות של 800 מיקרוליטרים, חיץ כביסה גרעינית נוספה. והצינור התהפך בעדינות כדי לשקם את הגרעינים.
הצינור היה סובב שוב ב 300 RCF, במשך ארבע דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר שלוש שטיפות בסך הכל, הגרעינים שהתקבלו שולבו בצינור צנטריפוגה טרי של 1.5 מיליליטר, והסתובבו ב 300 rcf, במשך ארבע דקות ב 4 מעלות צלזיוס. קצה פיפטה שימש להסרת המאגר הנותר ככל האפשר.
השלב הבא היה הדגירה של הנוגדן. aliquot של 50 microliters של גרעינים היה resuspended ב 1 מיליליטר של חיץ נוגדנים בתוספת EDTA, BSA, קוקטייל מעכב פרוטאז דיגיטונין. aliquot של 150 מיקרוליטר של השעיית הגרעינים הונח בצינור טרי 1.5 מיליליטר לתגובה אחת, שני מיקרוליטרים של נוגדנים נוספו לכל צינור.
בבדיקה זו, שני שכפולים ביולוגיים עבור נוגדן אנטי-היסטון-H3-ליזין-4-טרימתילציה ו immunoglobulin G קבוצות בקרה שליליות הוקמו לאחר נוגדנים נוספו. הפתרון היה מעורבב בעדינות, ואת הצינורות נותרו על שייקר אופקי עבור הכלאה לילה בארבע מעלות צלזיוס ב 12 סל"ד. למחרת בבוקר, הצינורות הוצאו והגרעין נשטף באמצעות 800 מיקרוליטרים של חיץ שטיפת משקעים חיסוניים.
הצינור היה הפוך בעדינות לערבוב והוא נשאר על שייקר אופקי במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ב 12 סל"ד. לאחר הכביסה, הצינור היה סובב ב 300 rcf במשך ארבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, supernatant הוסר באמצעות קצה פיפטה.
זה חזר על עצמו במשך שלוש כביסות בסך הכל. לאחר השטיפה השלישית, הצינור היה סובב 300 rcf במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס, וקצה פיפטה שימש כדי להסיר את המאגר הנותר ככל האפשר. כדי להכין את תערובת Tn5 transposase לדגירה.
מיקרוליטר אחד של טרנספוזאז נוסף לכל 150 מיקרוליטרים של מאגר הדגירה של טרנספוזאז. אנו ממליצים להכין את תמהיל פתרון transposase הראשון על פי מספר התגובות. ואז להוסיף aliquot של 150 מיקרוליטרים לכל צינור.
התמיסה התערבבה בעדינות והושארה על שייקר אופקי בטמפרטורת החדר ב-12 סל"ד למשך שעתיים. הצינורות היו מעורבבים בעדינות כל 10 עד 15 דקות. לאחר הדגירה, הגרעינים נשטפו שלוש פעמים באמצעות 800 מיקרוליטרים של חיץ שטיפת משקעים אימונו בטמפרטורת החדר כדי להסיר את החילוף Tn5 מאוגד.
לאחר השטיפה השלישית, הצינור היה סובב ב 300 rcf במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס, וקצה פיפטה שימש להסרת החיץ הנותר. עבור שלב התיוג, 300 מיקרוליטרים של מאגר תיוג נוספו לצינור התגובה. הפתרון היה מעורבב היטב ודגר ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
לאחר הדגירה נוספו 10 מיקרוליטרים של 0.5 מול לליטר EDTA ב-30 מיקרוליטרים של 10% SDS כדי לקבוע את התגובה. 300 המיקרוליטרים הבאים של מאגר חילוץ דנ"א נוספו. בוצע חילוץ דנ"א לא סדיר.
שברי הדנ"א הומסו ב-25 מיקרוליטרים של מים סטריליים. 24 מיקרוליטרים שימשו להגברת PCR בבניית ספריית NGS. נתון זה מציג את כתם הגרעינים השלם עם DAPI בתמונה, תחת מיקרוסקופ המשיג כמות מספקת של גרעינים שלמים ונקיים יחסית הוא הצעד הקריטי עבור CUT&Tag.
לאחר PCR, שני מיקרוליטרים הועברו וגודל ה- DNA נבדק על 1.5% ג'ל אגרווז. נתון זה מראה כי להשוות עם שליטה שלילית בגן אימונוגלובולין. עיקר שברי הדנ"א מדגם הייסטון H3 ליזין 4 טרימתילציה צריך לנוע בין 280 ל 500 זוגות בסיס.
ניתן לטהר את שברי הדנ"א ולאחר מכן לפרופיל על ידי רצף תפוקה גבוהה. נתון זה מציג את רצף יצירת התוצאות עבור נוגדן האנטי-היסטון H3 ליזין 4 טרימתילציה בהשוואה לקבוצות בקרה שליליות אימונוגלובולין G. טכנולוגיה זו מייצרת את ספריות ה- DNA ברזולוציה גבוהה ורקע נמוך במיוחד באמצעות מספר קטן של תאים עם הליך פשוט בהשוואה ל- ChIP-seq.
CUT&Tag היא שיטה חדשה ועדיין מתבצעת.
