מחקר זה מציג זרימת עבודה חדשנית לגילוי SARS-CoV-2 על משטחים המנקים לעתים רחוקות בסביבה העירונית, כגון ידיות משאבת גז, גני שעשועים וכספומטים. במגיפה, האספקה נדירה. אנו משתמשים בחומרים הניתנים להשגה בקלות ריאגנטים וציוד זמין בהגדרות מעבדה בסיסיות.
אנו משתמשים בשיטת מיצוי המשמרת את ה- RNA ללא שרשרת קרה, ושיטת זיהוי עמידה בפני מעכבים. פרוטוקול זה הוא אינטרס בריאות הציבור. הוא מספק מסגרת להערכת מאגרים ויראליים סביבתיים למגפת COVID-19 הנוכחית וסוכנים זיהומיים אחרים במהלך התפרצויות עולמיות עתידיות.
לגייס מדענים אזרחיים באמצעות קריאה ישירה וברורה לפעולה שפורסמה באמצעות מדיה מקומית וחברתית. צור מזהה ייחודי (handle) של מדיה חברתית כדי לחבר את הנושא בין תוכן מדיה חברתית. צור קישור ל- SMP, המספק תוסף רב-לשוני כדי לאפשר ניווט בשפות מרובות עבור אנשים להגיש בקשה להשתתף במאמץ הדגימה הסביבתית על-ידי מענה על שאלות הקשורות ל- biosafety שצוינו בטופס מקוון.
כלול במקטע הדגימה פרוטוקולים גרפיים ושמעיים באנגלית ובספרדית. דמיין נתונים גאו-מרחביים באמצעות ממשק תכנות יישומים גאו-מרחבי בהנחיית ספק שירותי מחשב בענן. אחסן את הנתונים שנשלחו ל- LIMS באמצעות SMP כדי להקל על אחסון מרכזי, מעקב אחר תהליכי עבודה של עיבוד וניהול הלוגיסטיקה.
טען מראש מידע כגון מזהה ערכה לדוגמה, מזהה לדוגמה, תאריך, שעה וקואורדינטות מערכת מיקום כלליות כדי לאפשר תאימות של סוגי נתונים ולמזער את השגיאה. כלול קישור לדוגמה לבקשת איסוף עבור המשתתפים, שבו הם יכולים להשתמש לאחר שאספו את כל הדגימות. בנה ערכה המכילה את כל ציוד הדגימה, כולל ציוד המגן האישי הדרוש, כגון מסכה וכפפות, פרוטוקול דגימה ומידע רלוונטי לאבטחה ביולוגית.
ספוגית לעתים רחוקות חיטוי משטחים במשקי הבית ובסביבה העירונית על ידי הרטבת ספוגית פוליאסטר מרובע סנטימטר אחד סופג עם חומר ניקוי וניקוי משטח של 10 ס"מ בריבוע. בעזרת קיסם, להטביע כל דגימת דגימה בצינור שכותרתו מראש המכיל 200 microliters של guanidinium thiocyanate. ללבוש את המסכה שסופקה זוג חדש של כפפות עבור האוסף של כל מדגם, כדי למנוע זיהום צולב.
לאחר סיום הדגימה, השתמש בחיטוי הידיים שסופק. לאחסן את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס עד שהם מועברים למעבדה. ברגע שהדגימות מגיעות למעבדה, אחסנו אותן במינוס 80 מעלות צלזיוס.
כדי להגביר את מהירות ההקרנה, לעבד את הדגימות בבריכות. אם מאגר הוא חיובי, לחלץ את ה-RNA של כל מדגם באופן עצמאי. שלב את הדגימות מכל ערכת דגימה לשתי בריכות על ידי איגום 50 מיקרוליטרים של כל אחת משמונה הדגימות לצינור מיקרוצנטריפוגה ושמירת הדגימות הנותרות במינוס 80 מעלות צלזיוס.
הוסף 80 מיקרוליטרים של כלורופורם ומערבולת במשך 15 שניות. ואז דגירה במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. צנטריפוגה ב 13, 000 פעמים G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
מעבירים את השכבה המ מימית לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש. אחסנו את שאר הממשק והנוזל הוורוד במקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס. שברים אלה מכילים DNA וחלבונים.
לחלץ RNA משכבת מימית התאושש באמצעות פרוטוקול מיצוי גולמי RNA מבוסס guanidinium. הכינו את תערובת התגובה RT-LAMP בטמפרטורת החדר עם נפח עודף של 10% כדי להסביר את אובדן הצינור. הוסף חמישה מיקרוליטרים של RNA לתגובת המדגם וחמישה מיקרוליטרים של RNA בתוספת 2.5 מיקרוליטרים של SARS-CoV-2 RNA סינתטי לתגובה הממוסמרת.
הוסף 2.5 מיקרוליטרים של SARS-CoV-2 סינתטי RNA לשליטה חיובית וחמישה microliters של מים לשליטה שלילית. מערבבים היטב ומסובבים את התגובות. עבור התבוננות עיוורת, תוצאה שלילית מסומנת על ידי ורוד ותוצאה חיובית מסומנת על ידי צהוב.
לאחר RT-LAMP, בצע אלקטרופורזה ג'ל. ההפצה של אתרי איסוף לדוגמה מוצגת כאן. רוב הערכות הושלמו, והנתונים המתאימים הועלו ל- LIMS.
מגבלת הגילוי בתדר של 100% הייתה 500 עותקים לכל 25 מיקרוליטרים של תגובה. ב- RT-LAMP הצבעוני, דגימות חיוביות שינו צבע מוורוד לצהוב עקב שינוי pH משמונה ל- 5.5. במספרי עותק נמוך, דגימות היו לרוץ על ג'ל agarose כדי לאשר את החיוביות עם דפוס דמוי סולם וכתוצאה מכך.
שיטות QPCR RT נבדקו עם דגימות סביבתיות. כל תערובות האב היו רגישות למעכבים בריכוזי מספר עותק נמוך של השליטה החיובית. בריכוזים נמוכים של התבנית, שיטות PCR RT מסורתיות הראו תוצאות חיוביות שגויות ותשלילים כוזבים.
לבסוף, טכניקה הנקראת הגברה מעגלית מתגלגלת זיהתה כמויות קטנות של רצף היעד. עם זאת, זה הראה הגברה של החללית בהיעדר תבנית RNA. חיוני לשחרר קריאה לפעולה שמגיעה לכל המגזרים בקהילה כך שהדגימה באמת מייצגת את הסיכון לחשיפה של כל חברי הקהילה.
מסגרת זו מזהה חומר גנטי SARS-CoV-2. מחקרים לבדיקת כדאיות נגיפית הם השלב הבא.
