וידאו זה יתמקד בהכנת סלמונלה שמרים לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית נעבור על זרימת עבודה מטיפוח תאים לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית Saccharomyces cerevisiae מעובדים להכנת דגימת יונים בהשעיה מומלץ לעבוד בתנאים סטריליים בתוך תיבת זרימת למינאר עשרה מיליליטר של שמרים סטריליים המופקים לבינוני לגידול תאים מתווספים לחיטוי בקבוקון טיפוח אחד מיליליטר של סטרילי עשרים אחוז גלוקוז מתווסף בקבוקון עם גידול בינוני מושבת שמרים אחת נקטפת בקפידה מצלחת הטיפוח שלנו ומועברת למדיום הצמיחה המוכן בטיפוח בקבוקון גידול מכוסה לאחר מכן בנייר כסף ומעורבב היטב לפיזור תרבית התאים ממוקמת באינקובטור ומטופחת בשלושים מעלות עם תסיסה מתמדת עד שהשלב המעריכי מגיע לתרבות תאי השמרים גדלה לשלב מעריכי וצפיפות הפיזיות של התא נמדדת על ידי החזקת מד נגד מדיום נקי כתרבית תאים לדוגמה ייחוס מרוכזת OD1 או OD30 בנוסף לחמישה אחוזים של גלצל לפני מקפיא בלאנש רשתות אלקטרו-מיקרוסקופיות פני השטח מנוקה ומופעל ליישום של השעיית תאים על ידי רשתות פלזמה ממוקמים בתא זוהר משחרר מול צד פחמן כלפי מעלה והליך ניקוי פלזמה מוגדר שלושים עד ארבעים וחמש שניות רשתות EM יש עכשיו והם מוכנים לתא יישום מדגם Vitrification של השעיית תא שמרים על רשתות EM נעשה על ידי קיפאון בלאנש לתוך האתאן הנוזלי באמצעות מכונת Vitrobot הכנת אתאן נוזלי מתרחשת על ידי נוזלי גז אתאן בכוס מתכת מקורר עם רשת EM חנקן נוזלי עם השעיית תא נמחק על ידי נייר מסנן מהצד האחורי ועל ידי פלסטיק לא דבק כפוף מהצד הפחמן הקדמי הטמפרטורה בתוך תא Vitrobot מוגדר 18 מעלות ולחות עד מאה אחוז זמן המתנה, זמן כתם וכוח כתם מוגדרים על מסך Vitrobot כמו גם רשת הפרשות הזוהרת נבחרה על ידי פינצטה Vitrobot ומורכבת למכשיר שלוש נקודה חמש מיקרוליטרים של השעיית Cerevisiae Saccharomyces מוחלת על צד הפחמן של הרשת בתוך תא האקלים Vitrobot מתלה צריך להיות מעורבב כראוי לפני כל יישום של הרשת הוא blanche קפוא לתוך רשתות אלקטרו-מיקרוסקופיה אתאן נוזלי עם תאים מנוטרלים מאוחסנים בתנאי חנקן נוזלי או מותקנים לתוך מחסנית הרשת לטעינה לתוך רשת מיקרוסקופ SEM קריו עם תאים מנוטרלים מאובטחת לאחר מכן לתוך מחסנית הרשת המתאימה לטעינה הן SEM והן TEM מיקרוסקופים C-clip טבעת רכובה על כלי גזירת העיתון מקורר ברשת חנקן נוזלי ממוקם על מחסנית רשת פחמן פונה כלפי מטה עם דגימת טבעת C-קליפ ממוקמת בתיבת הרשת המיוחדת דגימה להכנת למילה נטענת למיקרוסקופ FIB/ SEM של קרן כפולה ומתאימה לסיר טעינת תא ההכנה של שלב הקריו מקורר כראוי ומלא במחזיק דגימת חנקן נוזלי הנקראת מעבורת ממוקמת ומתקררת גם תיבת רשת עם דגימה מועברת מהערת האחסון לסיר והרשתות ממוקמות לשני חריצים שאטל צד פחמן עם תאים מול למעלה במקרה של שימוש מחסניות רשת FIB לחתוך את מחסנית הרשת צריך להיות מיושר בזהירות ל12: 00 ברשתות המעבורת הידוק על ידי הבורג ואת המעבורת הוא התהפך עד עמדת טעינה סיר ממוקם בתחנת העברה מכוסה מכסה תא העברה עם סיר טעינה ממוקם על החלק העליון של המכסה נשאב דרך שאטל ואקום נמוך עם רשתות מהודק על המוט וסגור בתוך תאי תא ההעברה הקטנים הנאספים לתא ההכנה נשאבים והמעבורת מוכנסת על בימת הקריו בשלב תא SEM ואקום גבוה מוטה לארבעים וחמישה מעלות ומוזז ארבעה מילימטרים על המיקום המרכזי של הרשת החדרת המחט של מערכת הזרקת גז יוצרת שכבת הגנה של אורגני על דגימה ביולוגית מפני נזקי קרינה במהלך התמקדות רשתות כרסום קרן יון יון לאחר מכן sputter מצופה רעלה דקה של מתכת אנאורגנית כדי ליצור שכבה מוליך על חומר ביולוגי ממוקד קרן יון טחינה של lamella באשכול התא או monolayer נעשה בשלב כמה צעדים מועבר לאזור זווית כרסום של עניין נמצא דפוסי כרסום העליון והתחתון נוצרים lamella מחוספס הוא טחון עם ירידה הדרגתית של זרם FIB ועובי lamella הליטוש הסופי של lamella הוא מבוצע רק עם דפוס עליון וזרם FIB נמוך כדי למנוע נזק בקצה הקדמי ואפקט וילון על קרן אלקטרונים משטח lamella מראה את ההתקדמות במהלך תהליך הטחינה כאן אנו יכולים לראות את lamella המלוטש הסופי העובי הסופי של lamella צריך להיות פחות ממאתיים וחמישים ננומטר כדי להיות שקוף להעברת קרן אלקטרונים האיור של lamella כרסום באשכול תאים ו monolayer עם יתרונות וחסרונות של שתי רשתות הסוגים לדוגמה עם לאמלי מועברות בעדינות רבה דרך תא ההכנה בחזרה לסיר ההעמסה מקורר ומלא בחנקן נוזלי טרי ונקי כדי למנוע זיהום קרח של רשתות לאמלי טחונות מוסרות מהמעבורת ומוחזרות חזרה לדגימה של תיבת הרשת עם לאמלי טחון מועברת סוף סוף לרשת מיקרוסקופ קריו אלקטרונים של תיבת ההילוכים צריכה להיות 90 מעלות מסתובבת לפני הכניסה לקלטת הטעינה האוטומטית של TEM כדי להבטיח אוריינטציה נכונה של lamella ביחס לגישה להטיית TEM Lamili נבדקים ואזור עניין לרכישת נתונים טומוגרפיים קריו-אלקטרונים הוא מקומי הציר הראשי Lamella הוא מאונך לציר ההטיה של המיקרוסקופ כדי לראות את שדה הראייה הנכון בזוויות הטיה גבוהות השיטה הדוזימטרית משמשת לאיסוף נתוני טומוגרפיה של אלקטרונים קריו שנאספו טומוגרמה מעובדת לאחר מכן בתוכנת אטומו ומונולאייר מחולקת באמירה תוכנה בפרוטוקול זה הראינו לך כיצד להכין ביעילות דגימת תא שמרים עבור מכונת מיקרו lamella באמצעות כרסום קרן יונים ממוקד קריו וכיצד להכין ולעבד נתוני טומוגרפיה אלקטרונים ותא lamali
