הפרוטוקול שלנו מתאר שיטות מפורטות כדי לפברק ולנתח תרבית מיקרוטיסו של שלד אנושי 3D. מיקרוטיסוות שרירים ניתן ליישם מחקרים של ביולוגיה שריר בסיסית, מודל מחלות, או לבדיקת מולקולות מועמד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הערכה במקום של כוח התכווצות וסידן ארעי.
בגלל זה, אתה יכול לנהל מחקרים אורך של תפקוד רקמת השריר. שיוכיחו את ההליך יהיו ברנן מסגרייב והטה לאד, סטודנטים לתואר שני מהמעבדה שלי. שעתיים עד שלוש שעות לפני זריעת התא, מניחים צלחת טקטיקה קלה היטב לתוך צלחת תרבית תאים 10 ס"מ.
הכן כל תרבות מיוטקטית בנפרד היטב על ידי הוספת 100 מיקרוליטרים של פתרון F-127 פלורוני 5%. השתמש במכסה כדי לכסות את בארות, ולהחיל סרט פרפין כדי לאטום את המנה. צנטריפוגות את המנה ב 1, 550 פעמים G במשך דקה אחת בצנטריפוגה מצויד מתאם ספינר צלחת.
מאחסנים את צלחת התרבות בארבע מעלות צלזיוס עד התאים מוכנים לזרוע. ואז להפשיר לאט 150 aliquot מיקרוליטר של תמצית קרום המרתף, ו 110 aliquot מיקרוליטר של תרומבין על קרח בשכונת התרבות. עבודה במכסה המנוע תרבית התא, להוסיף 700 microliters של 0.9% תמיסת מלח צינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר המכיל שבעה מיליגרם של פיברינוגן אבקת.
מניחים את הצינור בחממה של 37 מעלות צלזיוס לתרבות תאים למשך שלוש עד חמש דקות ללא מערבולת. הסר ולהעיף את הצינור בעדינות, ולאחר מכן הדופק לסובב את התמיסה מומסת בצנטריפוגה מיקרו לפני החזרתו למכסה המנוע התרבותי. סנן את פתרון הפיברינוגן באמצעות מזרק מיליליטר אחד מצויד במסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
לאחר מכן להעביר את פתרון פיברינוגן מומס לקרח לצד תמצית קרום המרתף aliquots תרומבין. להכין ולחמם מראש את מדיה צמיחת הרקמות ב 37 מעלות צלזיוס, אשר יוצג בארות התרבות לאחר זריעת הרקמות. הסר את לוחות תרבית התא מן האינקובטור ושאף את התקשורת התרבותית.
לאחר מכן לשטוף את התאים פעם אחת על ידי הוספת חמישה מיליליטר של DPBS לתוך כל צלחת תרבות. שאפו את ה- DPBS וניתקו את התאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין EDTA לכל מנת תרבות. מניחים את הצלחת באינקובטור תרבית התא במשך שלוש דקות, מחזיקים את טריפסין על ידי הוספת שלושה מיליליטר של מדיום כביסה לצלחת התרבות, ולאחר מכן להעביר את התאים לצינור חרוטי בגודל המתאים.
גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 400 פעמים G במשך 10 דקות. שאפו את התקשורת בזהירות מבלי לפגוע בכדור התא, ואז השעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של מדיום הכביסה. ספירת התאים באמצעות hemocytometer וצבע כחול טריפן תחת מיקרוסקופיית שדה בהירה.
כדי לזרוע שש רקמות, להכין מספיק תאים מטריצה חוץ תאית עבור שמונה רקמות, ובכך להסביר הפסדים היווצרות בועה. להעביר 1.2 מיליון תאים לצינור חרוט חדש, ולאחר מכן להגדיל את הנפח ל 10 מילימטרים עם לשטוף בינוני. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 400 פעמים G במשך 10 דקות.
הכן 150 מיקרוליטרים של תערובת ECM בצינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר, ולאחסן את התערובת על קרח עד השימוש. שאפו את התקשורת מן הצינור חרוטי המכיל את התאים, דואגים למנוע את גלולה התא. מעביר במרץ את קצה הצינור עם אצבע בכפפה עד שהכדור מופיע כתרנגולת.
העבר 120 מיקרוליטרים של פתרון ECM לצינור המכיל את התסיסה של התא, ובזהירות pipette למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש לחלוטין את התאים בתוך ECM כדי ליצור השעיה תא אחד. הימנע יצירת בועות, ולאחר מכן מניחים את השעיית ECM התא על קרח עד השימוש. מניחים את צלחת 10 ס"מ בקירור המכילה את בארות myotactic על גבי חבילת קרח בתוך מכסה המנוע תרבות התא, ושאפו את פתרון F-127 פלורוני מכל באר.
אפשר פתרון F-127 פלורוני שיורית לשחרר מן PDMS נקבובי, להתיישב לתחתית הבאר על ידי מתן בארות לשבת במשך חמש דקות על קרח, ולאחר מכן לשאוף שוב. Pipette השעיית ECM התא בזהירות להשעות מחדש את התאים, ולאחר מכן להעביר 105 microliters של ההשעיה לתוך צינור טרי, מקורר מראש 1.5 מיליליטר על ידי אחיזתו קרוב לפסגה. הוסף 0.84 מיקרוליטרים של 100 יחידות למיליליטר פתרון מלאי תרומבין ל 105 microliters של השעיית ECM תא.
Pipette במהירות וביסודיות לערבב, הימנעות כניסת בועות. מוסיפים 15 מיקרוליטרים של תערובת ECM התא לכל באר מבלי ללחוץ על הפיפטה לתחתית הבאר. בשתי תנועות אור, פזור את מתלה התא מאחורי כל עמוד בבאר.
מניחים את המכסה על צלחת התרבות 10 ס"מ ומעבירים אותו לאינקובטור תרבית רקמות צלזיוס של 37 מעלות במשך כחמש דקות. הוסף 200 מיקרוליטרים של מדיה לצמיחת רקמות שחוממה מראש לכל באר מיוטקטית לאחר שתערובת ה- ECM התאית הפכה לפולימרית. החליפו את המכסה על צלחת 10 ס"מ ולשמור אותו באינקובטור עד ההבחנה.
במהלך תקופת תרבית של 14 יום, myoblasts הציג את ההיבטים של רקמה מקומית על ידי ארגון עצמי בטקטיקה קלה גם כדי ליצור microtissue 3D עם מיוטיובים מפוספסים מרובי גרעין. Myotubes יש פסים sarcomere, אשר היו דמיינו על ידי חיסון עבור actinin אלפא סרקומרי. כדי להשיג מיוטיובים מיושרים היטב, שגיאות טכניות כגון היווצרות בועה בעת צנרת, או ציפוי פלורוני מזיק במהלך השאיפה, יש להימנע.
תזוזה מייצגת של פוסט צלחת הבאר myotactic בתגובה לגירוי חשמלי בתדר נמוך וגבוה, מוצג כאן, המציין כי myotubes מגיב לגירויים חשמליים שונים להתכווץ בהתאם. כימות של עקירת הפוסט מאפשר המרה לכוח התכווצות מוחלט של הממ"ד. ארעיות סידן על הממ"ח העשויה ממימובלטס GCaMP6-transduced נותחו גם בתגובה לגירוי בתדר נמוך וגבוה.
כימות של עוצמת פלואורסצנטית יכול לשמש מדידה עבור תכונות טיפול סידן של MMTs. רוב האנשים המבצעים זו זריעת רקמה בפעם הראשונה, נאבקים עם הוספת מטריצה חוץ תאית לבארות, ועם היווצרות בועה. אנו ממליצים לתרגל את הטכניקה על כמה בארות תרבות microtissue חילוף עם פתרון צמיג פשוט מאוד לפני הניסיון הראשון עם תאים.
