פרוטוקול זה מתאר תהליך ניסויי שלב אחר שלב ואלגוריתם מתמטי לכימות FRET באמצעות מרווה של תורמים ופליטה רגישה למקבל. כימות יעילות FRET בתא החי מחייב קביעת ההצלבה בין החלבונים הפלואורסצנטיים ויעילות הפליטה והגילוי היחסית של הפלואורופורים במערך המיקרוסקופי. Crosstalk ניתן להעריך על ידי תאי הדמיה המבטאים רק פלואורופור אחד.
הערכת יעילות הזיהוי של מולקולה תורמת או מולקולה מקבלת דורשת ידע על היחס בין מספר המולקולות התורמות והמקבלות היוצרות את אות המדידה. מספר הפלואורופורים המבוטאים בתאים חיים משתנה מתא לתא ואינו ידוע. בדיקת הכיול המשמשת בשיטה זו, חלבון היתוך תורם-מקבל אחד-אחד, מאפשרת לקבוע את יעילות הזיהוי היחסית של מולקולות תורם ומקבל.
כדי להתחיל, השתמש בווקטור ביטוי תאי יונקים N1 עם mCherry 1 ליצירת בדיקת ההיתוך EGFP mCherry 1. תכנן אוליגונוקלאוטידים להגברת EGFP ללא קודון עצירה כמקטע BAM h1 של תא אחד. חמש חומצות האמינו המקשרות בין החלבון הפלואורסצנטי הירוק והאדום אמורות להניב מחסור ממוצע ב-FRET עבור זוג תורמים-מקבלים דובדבן GFP של 0.25 עד 0.3.
השתמש בכל קו תא ומדיה ללא אדום פנול כדי להפחית פלואורסצנטיות ברקע. ברגע שהתאים נפגשים ב-80%, נתקו אותם עם מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין EDTA וזרעו כ-10,000 תאים לכל באר של צלחת בעלת שמונה בארות על ידי הוספת שלוש טיפות מתרחיף של חמישה מיליליטר. 24 שעות לאחר הציפוי, יש לבצע טרנספקציה של התאים באמצעות אמצעי טרנספקציה מתאים.
יש לדגור על התאים במשך 20 שעות לפני הדמיית תאים חיים כדי לאפשר ביטוי תקין של חלבונים פלואורסצנטיים, קיפול והבשלה. דמיינו את התאים בתא סביבתי לח ומחומם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמצעות מיקרוסקופ סורק קונפוקלי. כדי לאגור את מדיה התא ב pH פיזיולוגי, להוסיף HEPES 20 מילימולרי כדי להפוך את מדיה התא פחמן דו חמצני עצמאי.
לאחר מכן הרכיבו את המגלשה על המיקרוסקופ. השתמש בקו 488 ננומטר של לייזר יון ארגון כדי לעורר את GFP ובלייזר דיודה 561 ננומטר כדי לעורר דובדבן. הגדר את הלייזר 488 ננומטר לעירור בערוץ הראשון דרך רצועת פליטה של 505 עד 530 ננומטר ובערוץ השני עם מסנן מעבר ארוך של מעל 585 ננומטר.
השתמש בלייזר 561 ננומטר לעירור בתעלה שלוש עם מסנן מעבר ארוך של מעל 585 ננומטר. הרגש את שני הלייזרים ברצף והגדר את מצב ההדמיה לעבור אחרי כל שורה, כך שהעירור של התמונה בגודל 512 על 512 פיקסלים יתחלף לאחר כל שורה. הגדר מיני סדרת זמן של שלוש תמונות כדי לזהות אם מתרחשת הלבנה משמעותית ולהפחית את עוצמת הלייזר במידת הצורך.
ראשית, תאי תמונה המבטאים את מבנה היתוך הדובדבן GFP. קבעו את הפרמטרים המגדירים עוצמת לייזר משולבת זמן לפיקסל בתמונה קונפוקלית. השתמש במטרה שמן של 63X והגדר זום ל- 3X כדי לצלם תא בשלמותו עם הגדלה ורזולוציה מספיקות.
כוונו לגודל פיקסלים של 70 עד 80 ננומטר. הגדר את זמן השהייה של פיקסלים לשתיים עד ארבע מיקרו-שניות ואת שידור AOTF עבור לייזר 488 ננומטר ו- 561 ננומטר, כך שהתמונות יציגו יחס אות לרעש טוב ללא הלבנה וללא פיקסלים המציינים רוויה בעוצמת פלואורסצנטיות. התאם את עוצמת הלייזר של 488 ו- 561 כך שרמות האות בערוץ הראשון ובערוץ השלישי יהיו דומות.
הגדר את רווח מכפיל התמונות ל- 600 עד 800. תמונה 15 עד 20 תאים המבטאים את חלבון היתוך הדובדבן GFP, תאים המבטאים GFP, דובדבן, GFP ודובדבן, ותאים שאינם עוברים טרנסקטציה. לאחר מכן תאי תמונה מבטאים במשותף את החלבונים המעניינים המצומדים ל-GFP ולדובדבן בהתאמה.
כדי לחשב FRET, מדדו את אות התורם בערוץ הראשון, בערוץ התורם עם עירור של 488 ננומטר ורצועת פליטה של 505 עד 530 ננומטר. לאחר מכן מדוד את אות המקבל בערוץ שלוש, ערוץ המקבל עם עירור ופליטה של 561 ננומטר מעל 585 ננומטר. לבסוף, מדוד את אות FRET בערוץ השני, ערוץ ההעברה עם עירור ופליטה של 488 ננומטר מעל 585 ננומטר.
האות בערוץ השני הוא סכום של ארבעה מרכיבים שונים: הזליגה הספקטרלית מהאות התורם המרווה לערוץ הגילוי מעל 585 עם גורם crosstalk S1, האות המקבל מעירור ישיר על ידי 488 ננומטר אור עם גורם crosstalk S2, הפליטה הרגישה של המקבל על ידי FRET ממולקולת התורם הנרגשת, ואות הרקע. התמונות התקבלו בערוץ התורם, בערוץ ההעברה ובערוץ המקבל, תאים המבטאים GFP בלבד, דובדבן בלבד, ביטוי משותף של GFP ודובדבן, וחלבון היתוך דובדבן GFP. יעילות ה-FRET התאית הממוצעת המחושבת בתאי NRK המבטאים חלבון היתוך דובדבן GFP ובתאי דובדבן GFP המבטאים במשותף משורטטת לעומת יחס העוצמה בין המקבל לתורם או היחס המולקולרי בכל תא.
תמונות FRET מנורמלות של פיקסלים אחר פיקסלים של תאים המבטאים את חלבון היתוך הדובדבן GFP, מבטאים במשותף GFP ודובדבן כבקרה שלילית, ומבטאים תת-יחידות קולטן של קולטן אשוול-מורל מוצגות כאן. RHL1 ו-2 של לקטין הכבד של החולדה סומנו עם GFP ודובדבן בצד הציטופלזמי של קרום הפלזמה. יעילות ה-FRET התאית הממוצעת של תאים המבטאים GFP RHL1 ודובדבן RHL2 ו-GFP RHL1 מלאי דלתא ודובדבן RHL2 משורטטת לעומת היחס המולקולרי בין המקבל לתורם.
גישת FRET הכמותית המוצגת מאפשרת את הדברים הבאים. זיהוי אינטראקציות חלבוניות בהקשר הפיזיולוגי של התא החי. שינויים באינטראקציות חלבונים לאורך זמן.
הבדלים באינטראקציות בתאים תת-תאיים עד לרמת פיקסל אחר פיקסל של תמונה קונפוקלית. והתלות של אות FRET שזוהה ביחס המולקולרי בין קבלה לתורם המתבטא בתא חי.
