פרוטוקול זה מניב אזורי קוצב לב שלמים של אגן הכליה, איבר השריר החלק בתוך הכליה השאיבה שתן לתוך השופכן לתוך שלפוחית השתן. שלא כמו בידוד תאים מאגן הכליות, גישה זו מספקת שלם בסביבות ממוקמות של אזורי קוצב לב אגן הכליות והכנה פיזיולוגית יותר לחקר קצב אגן הכליות. אדם שמעולם לא ביצע טכניקה זו עשוי להיאבק לחתוך חלקים אחידים.
משתמש בפעם הראשונה חייב להבטיח שהכליה היא רמה על שלב הוויברטום ואינו מאיץ את תהליך החיתוך. באמצעות מלקחיים פנימיים של רקמות ומספריים פנימיים, צובטים את המעיים ומרימים אותם מקיר הבטן. בו זמנית לחתוך את החלק התחתון של המעיים חופשי מהגוף בתריסריון הפרוקסימלי ואת המעי הגס דיסטלי כדי לקבל גישה למרחב retroperitoneal המכיל את הכליות.
לצבוט בעדינות ולהרים את הקצה הדיסטלי של השופע עם מלקחיים רקמה. באמצעות מספריים ביתור, לחתוך מתחת השופכנות צבט לכיוון הכליה עד שהוא הפך משוחרר מרקמת החיבור שמסביב. ברגע שהכליות נחשפות, לחלץ אותם בנפרד.
מלאו צלחת מצופה אלסטומר מסיליקון בתמיסת KRB קרה כקרח. מעבירים את הכליה לצלחת הניתוח ומוודאים שהיא שקועה לחלוטין. השתמש במספריים קפיציים עדינים ובמלקחיים פנימיים כדי להסיר רקמת שומן מבסיס הכליה כדי לחשוף את אגן הכליה הדיסטלי, או RP, ואת השופך הפרוקסימלי.
הסר את השופך הפרוקסימלי וחלק של RP דיסטלי מהבסיס באמצעות מספריים קפיציים עדינים ומלקחיים. פירס כמוסת הכליה החיצונית עם מלקחיים קצה עדין, angling את הטיפים הרחק מגוף הכליה. באמצעות מלקחיים עם כל יד, לצבוט את הקצוות הרופפים של הקפסולה לקלף אותם לגזרים עד קרום כמוסת הכליה הנותרת מוסרת לחלוטין.
הכנס סכין גילוח למחזיק הלהב של מכשיר הוויברטום והתאם את זווית הסיווג של הלהב לכ-18 מעלות. התאם את פרמטרי הלהב כאמור בכתב היד של הטקסט, והבטח שעובי מקטע הכליות לא יעלה על 150 מיקרומטר, מה שישפיע לרעה על ניסויי הדמיית יוני סידן. השתמש במלקחיים קהים כדי לתפוס בעדינות ולהסיר את הכליה המוכנה מתמיסת KRB קרה כקרח.
מניחים מיד את הכליה על נייר סופג במשך כשנתיים עד ארבע שניות כדי להסיר לחות חיצונית עודפת. גלגלו בעדינות את הכליה על פני הנייר הסופג כדי להבטיח שכל צידי הפרנצ'ימה התייבשו כך שתהיה הידבקות אופטימלית של הכליה לשלב הוויברטום. יש למרוח מיד שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט על בסיס צלחת הדגימה של הוויברטום ולהשתמש במלקחיים קהים כדי להניח את צד השופך בכליות על האזור המכוסה בדבק.
יש למרוח בעדינות את הלחץ כלפי מטה על החלק העליון של הכליה עם הקצה השטוח של המלקחיים למשך כ-10 עד 20 שניות כדי לייבש את הדבק. אבטחו היטב את צלחת הדגימה לתחתית מגש החיץ והתאמו את רמת פתרון KRB כך שראש הכליה תהיה שקועה לחלוטין. לחיתוך ויברטום אוטומטי, בחר את תנוחות ההתחלה והסיום של מחזור חיתוך להב הוויברטום 0.5 עד 1 ס"מ מהכליה כדי להבטיח שכל מישור הכליות מקבל חתך.
התחל את תהליך החיתוך האוטומטי, ודא שהלהב יוצר קשר עם הכליה. באמצעות מלקחיים, לאסוף קטעים המשוחררים מן הכליה ומיד להעביר אותם לבארות בודדות. המשך פרוטוקול החתך והשתמש במיקרוסקופ קל כדי לזהות אזורי PKJ בפרוסות הכליות עד שאזורי PKJ יתבהרו יותר.
מלאו צלחת הדמיה מצופה אלסטומר מסיליקון בתמיסת KRB קרה כקרח. מעבירים פרוסת כליה בודדת לצלחת. הכנס סיכות Minutien סביב הפריפריה של פרוסת כליה כדי לאבטח את החלק לבסיס של צלחת ההדמיה.
מניחים את צלחת ההדמיה על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקלי מסתובב זקוף ומיד להתחיל זלוף עם פתרון KRB. השתמש בעדשה אובייקטיבית טבילת מים בהגדלה נמוכה כדי לאתר את פרוסת הכליה. מרכז את שדה ההדמיה באזורים של הפרוסה שבהם PKJ קיים באמצעות ציוני דרך.
לאחר PKJ ממוקם, להשתמש בעדשה יעד טבילת מים הגדלה גבוהה יותר כדי להגדיל את תחום העניין. להבחין תאים שונים של עניין בסוגים שונים של משכי זמן חולפים יוני סידן בקיר PKJ. לאחר זיהוי תאים בעלי עניין, התאם את עוצמת הלייזר כדי להניב יחס אות לרעש טוב ותיעד תמונות בתדר דגימה זמני בין 16 ל-32 הרץ.
תמונות מיקרוסקופיות בהירות של חלקי כליות שלמות מראות ציוני דרך מובאים של אזור PKJ יחיד. אזורי PKJ מרובים נוכחים קרוב למודולה הפנימית ולכליה הדיסטלית. מיקומם של עורקי הכליות PKJ וגבולות PKJ מוצגים כאן.
מקטע PKJ מעכבר המבטא GCaMP בתאים חיוביים אלפא PDGFR מוצג כאן. קיר PKJ דק תלוי בין רקמה אקדחת פרקימלית ניתן להבחין באמצעות ציוני דרך כגון עורק הכליות. הביטוי של GCaMP6f ברקמה מהונדסת ספציפית זו מתפשט על פני כל רוחב ה- PKJ הן על פני השריר והן על פני השכבות ההרפתקניות.
בפרוסות הכליות החיוביות PDGFR אלפא GCaMP6f, רשת של תאים המשתרעת בדרך כלל על פני רוחב דופן PKJ היא פלואורסצנטית ומציגה חולפי סידן מתנדנדים של משכי זמן ותדרים שונים. ב SMC GCaMP3 פרוסות כליה חיוביות, שכבה של תאים חיוביים GCaMP3 נמצאים בשכבת השריר. מפה spatiotemporal מראה כי PDGFR אלפא תאים חיוביים הממוקמים PKJ אדוונטיציה לעורר משך זמן ארוך בתדר נמוך סידן יון חולף, בעוד SMCs ירה ארעי סידן יון משך זמן קצר יותר בתדירות גבוהה יותר.
באופן דומה, נצפו גם מערך של אותות יוני סידן פלואורסצנטיים בתוך צינורות איסוף וצינורות סידן מתנדנדים ארעיים ב- SMCs. בעת ניסיון הליך זה, חשוב שהכליה היא ברמה ככל האפשר במהלך חתך ויברטום כדי להבטיח פרוסות כליה אחידות משוחררות מהבלוק. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון בידוד חד-תאי, אימונוהיסטוכימיה ומחקרים מולקולריים כדי להגביר את הבנתנו את מנגנוני קוצב הלב באגן הכליות.
