כאן, אנו מדגימים את שיטת Updegraff, השיטה הנפוצה ביותר בעולם להערכת תוכן תאית גבישית. תאית מורכבת בעצם מונומרים גלוקוז מקושר על ידי בטא 1, 4 קשרים גליקוסידיים. חילקנו את הפרוטוקול הזה לחמישה שלבים.
בשלב הראשון, אנו מכינים את החומר ביומסה הצמח. בשלב השני, אנחנו מוציאים את קיר התא הגולמי. בשלב השלישי, אנו משתמשים בטיפול Updegraff שבו Updegraff מורכב חומצה אצטית וחומצה חנקתית המסייעת בהסרת hemicellulose ו lignin מהדגימות שלנו.
בשלב הרביעי, אנו כפופים אותו חומצה הידרוליזה בעזרת חומצה גופרתית המייצרת מונומרים גלוקוז. לבסוף, בשלב החמישי, אנו משתמשים ב-anthrone assay כדי להעריך את תכולת התאית הגבישית. לאסוף את החומר הצמחי מהחממה, לשטוף אותם ביסודיות עם מים, אוויר יבש במשך יומיים, להפריד את הרקמה ולהעביר את הרקמה למיכלים המסומנים בנפרד דגירה באינקובטור ב 49 מעלות צלזיוס במשך 10 ימים.
ואז לבסוף, לחתוך לחתיכות באמצעות מספריים או להב. להקפיא את הרקמה ולהעמיס לתוך מרגמה ועלי לטחינה עדינה לתוך אבקה אחידה או לחילופין להשתמש מקפיא / טחנה. כאן, אנו מדגימים באמצעות מקפיא / מיל, אז אנחנו מעמיסים את דגימות הרקמה שלנו לתוך בקבוקונים שחיקה אלה ומניחים אותם במקפיא / מיל ולהפעיל את מהירות 10 CP במשך שלושה מחזורים.
אבקת הרקמות נאספת בצינור פלקון כפי שמוצג כאן. שוקלים 20 מ"ג של אבקת הרקמה ומעבירים לצינור שני מ"ל שקל מראש. הוסיפו מ"ל אחד של מאגר סולובליזציה של חלבונים להסרת חלבונים. מערבולת.
צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות. השלך את הסופרנט. חזור על שלב זה פעמיים נוספות.
מוסיפים מ"ל אחד של מים סטריליים לכדור השמור. מערבולת. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות. חזור על שלב זה פעמיים נוספות.
הוסף ML אחד של 70% אתנול לכדור שנשמר. מערבולת. מעבירים לבלוק צלזיוס שחומם מראש ב-70 מעלות עם רעידות בו זמנית למשך שעה. לאחר דגירה של שעה, צנטריפוגה ב 15, 000 סל"ד במשך חמש דקות.
חזור על שלב זה פעם נוספת. לכדור שנשמר, להוסיף מ"ל אחד של 100% מתילון. מערבולת. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות.
הוסף ML אחד של מתנול כלורופורם. מערבולת. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות. השלך את supernatant ולהוסיף mL אחד של אצטון. מערבולת.
דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות. להשליך מחדש את supernatant ואוויר לייבש אותם ב 37 מעלות צלזיוס לילה או להמשיך על ידי ייבוש ואקום.
לטעון את הדגימות שלך לתוך מייבש ואקום ואוויר יבש במשך שעתיים עד שלוש שעות או עד גלולה יבש לחלוטין. לשקול חמישה מ"ג של תמצית דופן התא המתקבל מהשלב הקודם. העברה לצינור כובע בורג 2 מ"ל.
כלול גם שליטה חיובית בשלב זה. השתמש בשני מ"ג של נייר מסנן Whatman למטרה זו. העבר לצינור כובע בורג של שני מ"ל.
הוסף 1.5 מ"ל של ריאגנט Updegraff לכל תמצית קיר התא שקל. וורטקס ודגרת ב 100 מעלות צלזיוס בבלוק שחומם מראש במשך 30 דקות. לאחר 30 דקות דגירה, להעביר למדף.
אפשר לו להתקרר על הספסל במשך 10 דקות. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד ל-10 דקות. להשליך את supernatant מבלי להפריע גלולה.
מוסיפים מ"ל אחד של מים סטריליים. מערבולת. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד ל-10 דקות. השלך 500 מיקרוליטרים של העל-טבעי.
הוסף מ"ל אחד של אצטון. מערבולת. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות. השלך ML אחד של העל-טבעי.
הוסף מ"ל אחד של אצטון. מערבולת. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות. השלך את העל-טבעי לחלוטין.
הוסף מ"ל אחד של אצטון. מערבולת. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות. השלך את הסופרנט.
יבש ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר דגירה של לילה אחד, העבר למדף. הוסף מ"ל אחד של 67% חומצה גופרתית. מערבולת.
דגירה ב 25 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת עם רעידות בו זמנית. לאחר דגירה של שעה, ודא את גלולה מומס לחלוטין. העבר למדף.
זהו השלב האחרון של החילוץ תאית. עכשיו הדגימות מוכנות לדילול דגימה. לדילול הדגימה, השתמשו ב-10 מיקרוליטרים של כל דגימה מהשלב הקודם והוסיפו 490 מיקרוליטרים של מים סטריליים.
חזור על זה לכל הדגימות הניסיוניות. להכנת עקומת הגלוקוז הסטנדרטית, הכינו מלאי טרי של מ"ג אחד לכל מ"ל גלוקוז והכינו אפס מיקרוגרם ל-200 ריכוזי מיקרוגרם על ידי הוספת מ"ג אחד לכל מ"ל גלוקוז במרווחים של 20 מיקרוליטר והגדלת הנפח הסופי ל-mL אחד עם מים סטריליים. יש ליטול 500 מיקרוליטר מכל תקן מוכן בצינור כובע בורג ולהוסיף 0.2% אנתרון מ"ל אחד.
ועכשיו הדגימות מוכנות לבדיקת אנתרון. הוסף מ"ל אחד של אנתרון שהוכן טרי. מערבבים מיד על ידי מערבולת ומעבירים לקרח.
חזור על הפעולה עבור כל הסטנדרטים והדגימות באותו אופן. לאחר מכן העבר לגוש צלזיוס שחומם מראש ל-100 מעלות למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות דגירה, להעביר קרח דגירה במשך חמש דקות על הקרח.
לאחר הדגירה, יש ליטול 200 מיקרוליטרים של כל דגימה בשלושה עותקים משוכפלים. חזור על הפעולה הן עבור תקנים והן עבור דוגמאות באותו אופן. וצלחת טעונה של 96 באר הועמסה לגלאי רב-מוד.
באמצעות תוכנית Smart Max Pro, הגדרנו את הגדרת המסנן ל- 620 ננומטר. סוג לוח לסוג של 96 באר. בחר את כל אזור הקריאה.
לחץ על אישור. קרא. קרא צלחת. אתה מקבל את קריאות הספיגה הן של תקנים והן של דוגמאות, שייאספו בגיליון Excel לצורך ניתוח נוסף והערכת תוכן תאית.
עקומת תקן גלוקוז מוכנה באמצעות ריכוזי הגלוקוז במיקרוגרם ל-mL על ציר x וערכי הספיגה המנורמלים של הריכוז המתאים ב-620 ננומטר על ציר ה-y. אנחנו מקבלים את קו הרגרסיה עם ערכי m ו- c בגרף הפיזור התואם שאנו משתמשים בו כדי להעריך את תכולת התאית הגבישית לדוגמה. בשלב הראשון, אנחנו ממוצע ערכי OD ב 620 ננומטר.
ואז נרמלנו את הנתונים על ידי חיסור הערך הריק. אנו מחשבים את ריכוז הסוכר באמצעות הנוסחה x שווה OD מינוס c/m שבו אנו מחברים c ו- m ערכים מהשלב הקודם של קו הרגרסיה בעקומה הסטנדרטית. מכיוון שהנפח הכולל ששימש לבדיקת אנתרון הוא 500 מיקרוליטרים, אנו מחלקים אותו בגורם דילול 2.
מכיוון שנפח הדגימה שהיה בשימוש היה רק 10 מיקרוליטרים, נתחלק עוד יותר ב-10 כדי לקבל מיקרוגרם לריכוז מיקרוליטר של גלוקוז השווה לריכוז מ"ג ל-mL. ואז השתמשנו בגורם הלחות 1.11 שהוא רווח הלחות בתהליך. ולבסוף, אנו מחשבים את אחוז התוכן תאית גבישית על ידי חלוקת אותו עם משקל דופן התא, אשר קרוב לחמישה מ"ג, ולהתרבות על ידי 100 כדי לקבל את האחוז.
ואז אנחנו ממוצע התוכן תאית גבישית של שלושה משכפלים ביולוגיים כדי לקבל את הערך עבור דגימות בודדות, אשר יושוו מול ממוצע קו ניסיוני אחר של שלושה משכפלים ביולוגיים. וניתן להשתמש במבחן t כדי לבחון את רמת המשמעות שלהם. כאן בטבלה A, אנו מציגים את ערכי הטבלה של הריכוז ואת OD בהתאמה ב 620 ננומטר, אשר שימש עוד יותר להתוות גרף פיזור וקו רגרסיה עם ערכי m ו- c ששימשו C להשגת הבדלי התוכן תאית בין שני קווי הניסוי.
לסיכום, שתי הדגימות מראות הבדלים בתאית. תודה שצפית.
