טכנולוגיית מיקרו-מערך פנוטיפ היא שיטה יעילה בתפוקה גבוהה הקובעת פונקציונלית פעילויות מטבוליות הסלולר בתגובה למגוון רחב של מטבוליטים כניסה. הניצול בטכנולוגיה זו נמדד בצורה של נשימה תאית שנקבעת על ידי כמות התפתחות הצבע המיוצרת על ידי הפחתת NADH של צבע אדום מבוסס טטרזוליום. בעבודה זו, נציג את השימוש של בדיקות מערך מיקרו פנוטיפ בהקשר של מיקרו אצות באמצעות מינים מודל כלמידומונס reinhardtii.
מטרת מחקר זה היא ליצור שיטה אמינה לאפיון פנוטיפינג מטבולי של מיקרו-אצות שניתן להשתמש בהן כדי להרחיב את מודלי הרשת המטבולית של האצות הקיימים או להנחות את השחזור של מודלים חדשים. זן כלמידומונס ריינהרדטי CC-503 ניתן להשיג ממרכז המשאבים כלמידומונס באוניברסיטת מינסוטה ארה"ב. לגדל את התאים טריס אצטט שומן מדיה שומן עד לשלב באמצע יומן.
בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהם במצב טוב וללא כל זיהום. סובב את התרבות ב 2000 G-כוח במשך 10 דקות. השליכו את הסופר-טבעי מבלי להפריע לכדור.
הכן מדיה ברז טרי המכיל 0.1% טטרזוליום סגול צבע D"הוסף אנטיביוטיקה שונה כולל טיימטין, אמפיצילין, וקנמיצין לתקשורת כדי לעכב צמיחה חיידקית. מדיה שמנה וצעד זה צריך להיות מושמט מחומרים מזינים, בהתאם לכל סוג צלחת. להשעות מחדש את הכדור ואת מדיית הברז הטרי לריכוז סופי של 1 מיליון תאים למיליליטר.
השתמש בלוחות בדיקה של מערך תרכובות כימיות, כגון מקורות פחמן, מקורות חנקן, זרחן ומקורות גופרית, ומקורות החנקן הפפטידים. לחסן 100 מיקרוליטר מספיק של מדיה עצמאית לתוך כל באר של לוחות החיבור. הקפד לשכפל את ההסתה.
יש לציין כי בשלב זה, תאים צריכים להיבדק עם כתמים גרם שלילי לפני ואחרי בדיקה כדי לפקח על זיהום חיידקי. הכנס את תרכובת כימית אזור assay לוחות לתוך מערכת קורא microplate. לדגור על כל הלוחות ב 30 מעלות עד שבעה ימים, ולתכנת את מערכת קורא המיקרו-לוח לקרוא את שינוי צבע הצבע כל 15 דקות.
כמו רוב קוראי microplate אינם מספקים מקור של אור מתמשך במהלך הדגירה, האצות צריך להיות מסוגל לבצע נשימה הטרוטרופית. לייצא את הנתונים הקינטיים גלם מקורא microplate כקבצי CSV, אשר לאחר מכן ישמש קלט לחבילת התוכנה microarray phenotype והתוכנה שלנו. כדי לבצע את ניתוח הנתונים microarray פנוטיפ, להשתמש בחבילת התוכנה מיקרו אריק OPM OmniLog הפנוטיפ הפועל בתוך סביבת תוכנת R.
ב- R studio, ממשק המשתמש הגרפי עבור R, התקן את חבילת OPM ואת יחסי התלות שלה באמצעות הפקודות המפורטות בכתב היד. נווט לספריה המכילה את קבצי ה- CSV של הנתונים הקינטיים וייבוא הנתונים באמצעות הפונקציה קרא OPM. ניתן לצבור את הנתונים הקינטיים ולהסתגר באמצעות הערכת פרמטרי pref.
השימוש ב- XY plot מאפשר למפות את מדידות ההחלמה או הצמיחה כפונקציה של זמן עבור לוחות 96-בארות. ניתן לדמיין את הנתונים כמפת חום באמצעות התוויית רמת הפונקציה כדי לאפשר סקירה השוואתית מהירה של הנתונים הקינטיים. השלב הבא הוא לזהות את התגובות והגנים הקשורים למטבוליטים החדשים.
במקרה של נוכחות של מודל קיים עבור האצות, ניתוח הנתונים ממערכת microarray פנוטיפ יכול לשמש כדי לחדד מודל זה. כאן אנו מציגים את הצינור בו השתמשנו לעידון רשת מטבולית בקנה מידה גנום עבור מודל כלמידומונס באמצעות נתוני מיקרו-array פנוטיפ. כאשר בדיקה מורכבת חדשה חיובית לניצול, פרופילי התגובה הרלוונטיים של המתחם מוגדרים באמצעות בסיס ידע מטבולי, מתן מספרי ועדת האנזים הקשורים.
הצעד הראשון הוא לחפש Kegg ו MetaCyc לזהות מספרי עמלת אנזימים, ECs, לתגובות באמצעות חילוף חומרים נמצאו מערכי תרכובות כימיות. לאחר מכן, אנו משתמשים במספרי EC המזוהים כבסיס חיפוש במשאבי ביאור אצות זמינים מרובים, כגון מכון הגנום המשותף, JGI, Phytozome ופרסומים ביקורת עמיתים. התגובות והמטבוליטים מתווספים למודל הרשת המטבולית של כלמידומונס reinhardtii מבוסס COBRA, iRC1080, כדי להרחיב ולזקק את המודל.
אם לא נמצאו ראיות גנטיות התומכות במספר EC, ניתן לבצע חיפוש מבוסס פרופיל כגון איטרטיבי ספציפי למיקום NCBI, NCBI PSI-BLAST, כדי לזהות גנים מועמדים הקשורים לתגובה. לאחר מכן התוצאות מוערכים באופן ידני. אלה העוברים שלב QC זה עם ערכי E פחות מ- 0.05 לרלוונטיות למספרי EC של החיפוש, מתווספים לאחר מכן למודל המדדי.
השלב האחרון בפרוטוקול זה הוא עידון המודל, הערכה והשוואה של המודלים. השתמש בארגז הכלים העדכני ביותר של COBRA גירסה 3.0 ובפלטפורמת MATLAB כדי לבצע את השלבים לעידון הדגם. לאחר התקנת ארגז הכלים קוברה, ניתן להוריד את דגם iRC1080.
לאחר מכן ב MATLAB, הדבר הראשון לעשות הוא לנווט לתיקיה המכילה את מודל הייחוס, iRC1080. הוסף את התגובות המזוהות עם הגנים המשויכים שלהם למודל המטבולי, כגון iRC1080, באמצעות פונקציות ארגז הכלים קוברה. הוסף תגובה ושנה שיוך גנים.
נווט לספריה המכילה את מודל iRC1080 והפעל את הפקודות כדי לטעון את המודל. שנה את שמו והוסף תגובה חדשה ואת הגן המשויך אליה. במקרים מסוימים כאשר המטבוליט אינו מיוצר תאיים, אבל נלקח מן המדיום, תגובות תחבורה עבור מטבוליטים חדשים צריך להיות נוסף למודל באמצעות פונקציית תגובת הוספה / חילופי להזין או פלט את המטבוליט לתוך המדיום החוץ תאי.
בדוק את ההתנהגות של התוצאה והמודל החדשים, לדוגמה, iBD1106, על ידי ביצוע ניתוח איזון שטף, FBA, באמצעות הפונקציה לייעל מודל CB בתנאים בהירים וכהים למקסם את הביומסה כפונקציית האובייקט. בין היתר, פתרון ה-FBA מפיק שלושה וקטורים את שטפי התגובה, את מחירי הצל של חילוף החומרים ואת התגובה מופחתת עלויות. כאן, דוגמה מסופקת כאשר מודל iRC1080 מושווה עם הגירסה המעודנת שלה, iBD1106, על ידי קבלת מחירי הצל המייצגים את הרגישות של הפונקציה האובייקטיבית ביומסה לשינויים ומטבוליטים בחשבון בכל דגם.
כאן אנו מראים עלילות XY נשימה וחלקות רמה של מקורות הפחמן ומקורות החנקן בוחנים לוחות ריקים ו- CC-503 בצבע צהבהב וסגול, בהתאמה. בתוך כל באר, עקומות נשימה מייצגות המרת צבע על ידי הפחתה כפונקציה של זמן. הפסגה המודגשת בלוח A מייצגת את גילוי אצטט כמקור הפחמן היחיד מלוח זה, אשר עולה בקנה אחד עם ספרות כלמידומונס.
ההשוואה בין מספר המטבוליטים שזוהו באמצעות שלוש שיטות שונות, iRC1080, שהוא המודל המטבולי של כלמידומונס שאוצר היטב, זמן כרומטוגרפיה הגז של הטיסה GC-TOF, ומסת המיקרו-array הפנוטיפ מראה כי רק שישה חפיפות מטבוליט בין שלושת הסטים, בעוד 149 היו נפוצים בין iRC1080 לבין ערכת הבדיקה של מיקרוארי הפנוטיפ. זה מראה כי בעוד כל טכנולוגיה יש כוח לקראת מחקר פרופיל מטבולי, ערכת בדיקות microarray פנוטיפ יכול להיות מקור משמעותי של מידע מטבולי חדש. המידע המתקבל שימש להרחבה ולחידוד מודל הרשת המטבולית iRC1080.
כאן, אנו משווים את התוכן של מודל iRC1080 ואת המודל המורחב iBD1106, כולל מספר התגובות, מספר חילוף החומרים ומספר הגנים. אנו מראים כי זיקוק המודל שלנו הוסיף מעל 254 תגובות לרשת החדשה שנוצרה. תגובות אלה מסווגות חומצות אמינו, dipeptides, tripeptides ותגובות תחבורה.
המטבוליטים שזוהו לאחרונה שימשו להרחבת רשת מטבולית ועידון המודל המטבולי הקיים של כלמידומונס ריינהרדטי. בדיקות microarray פנוטיפ יכול לשמש כדי לאפיין פנוטיפים מטבוליים של זנים קיימים ומבודדים. בנוסף, הפרוטוקול שבו השתמשנו בהקשר של אצות מיקרו יכול להנחות את עידון המודלים המטבוליים של מינים אחרים.
