מדידות כמותיות מדויקות של חלבונים חיוניות להבנת שיתוף הפעולה הדינמי והמרחבי בין חלבונים כדי להבין את המחלה בחזרה לביולוגיה. המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לספק זרימת עבודה משולבת של פרוטאומיה כמותית עבור דגימות רקמות, המשלבת פרופיל חלבון ללא תוויות ומבוסס תווית לגילוי סמן ביולוגי. במחקר זה, השתמשנו במכשיר Orbitrap Fusion כדי לכמת את החלבונים באמצעות גישות מבוססות תוויות וללא תוויות.
תמה רקמה היא אחד הצעדים המכריעים ביותר להצלחת ניסוי LC-MS-MS. קח 30 מ"ג של רקמה בצינור להכות חרוזים. לאחר הכביסה עם PBS, להוסיף 300 microliter של חוצץ אוריאה תמוגה המכיל שמונה אוריאה טוחנת, טריס, NaCl ו MgCl2.
באמצעות sonicator בדיקה, ליזה את התוכן של הרקמה. חזור על כך למחזור אחר. אם אתה מתבונן בכל רקמה שלמה בתחתית הצינור, להוסיף חרוזי זירקוניום לצינור הומוגניזציה הרקמה באמצעות מקצף חרוזים במשך 90 שניות, עם חמש דקות דגירה על קרח.
צנטריפוגה הדגימות סביב 6000 G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להפריד את פסולת התא מן supernatant. אוספים את הסופר-נט בצינור טרי ומערבבים את התמיסה באופן אחיד. לכמת את ריכוז החלבון ברקמות lysate באמצעות ריאגנט ברדפורד.
בשביל זה, למדוד את OD של המדגם ב 595 ננומטר ולהסיק אותו באמצעות גרף סטנדרטי כפי שמוצג על מסך זה. לאחר כימות החלבון, הפעל 10 מיקרוגרם של ליסאט רקמות על ג'ל 12%SDS-PAGE כדי לבדוק את איכות lysates. השלב הראשון בעיכול בתמיסה כרוך בהפחתת קשרים דיסולפידים, באמצעות TCEP.
לאחר תוספת של TCEP, לדגור על התוכן של הצינור במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. השלב הבא כרוך אלקילציה כדי למנוע את הקשרים דיסולפיד מופחתים מלהיווצר מחדש. מוסיפים חומר אלקילטינג כמו iodoacetamide ודגרה הצינור בחושך במשך 10 דקות.
לאחר הדגירה, להוריד את הריכוז הסופי של אוריאה לפחות טוחנת אחת על ידי דילול עם ארבעה עד שמונה כרכים של חוצץ דילול. בשלב זה, מומלץ לבדוק את ה- pH. השלב הבא כרוך בתוספת טריפסין לצינור, ודגורת הצינור בן לילה לעיכול יעיל.
למחרת, יבשו את הפפטידים המעוכלים ברכז ואקום, והמשיכו לשלב התפלה. כדי לבצע התפלת פפטידים, השתמש בעצות שלב C18. הפעל את קצה שלב C18 על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של מתנול, צנטריפוגה הקצה ב 1000 G במשך שתי דקות.
עכשיו, להוסיף 50 מיקרוליטר של acetonitrile ב 0.1% חומצה פורמית לשטוף את קצה הבמה, ושוב, צנטריפוגה הקצה. ליישב מחדש את הפפטידים המיובשים ב-50 מיקרוליטר של 0.1% חומצה פורמית. הוסיפו את הפפטידים המחודשים לקצה הבמה הפעיל.
חזור על שלב זה לפחות ארבע פעמים. כדי לשטוף את המדגם, להוסיף 50 microliter של 0.1% חומצה פורמית, ולחזור על שלב צנטריפוגה. לתמונת פפטידים, הוסיפו 50 מיקרוליטר של 40% ACN בחומצה פורמית של 0.1%, והעבירו אותו דרך קצה הבמה בצנטריפוגה.
חזור על שלב זה עם 50% ו 60% ACN ב 0.1% חומצה פורמית ולאסוף את הסינון בצינור טרי. יבשו את הפפטידים המותפלים באמצעות רכז ואקום. לפני ריצת LC-MS-MS, לכמת את הפפטידים באמצעות השיטה Scopes.
בשביל זה, לטעון שני microliters של מדגם reconstituted בבאר של צלחת microdrop, ולמדוד את הספיגה ב 205 ננומטר ו 280 ננומטר. חשב את הריכוז מהנוסחה המתוארת בשקופית זו. ברגע הפפטידים המותפלים מיובשים, הם מוכנים לכימות מבוסס תווית.
עבור תיוג iTRAQ, יש לשחזר את הפפטידים היבשים ב-20 מיקרו-ליטר של מאגר פירוק, המסופק בערכת התוויות של iTRAQ. ליישב מחדש את התוויות על ידי הוספת אתנול מהחינתון המסופק בערכה, ומערבבים היטב. מומלץ כי כל הצעדים להתבצע בהתאם להוראות היצרן.
הוסף את תוויות iTRAQ המעורבות הומוגניות לצינורות המתאימים שלהם ולאפשר את תגובת התיוג להתרחש. בסוף התגובה, להרוות כל תווית לא מאוגדת עודף בצינור על ידי הוספת מים ברמה MS, ודגרה במשך חצי שעה עד שעה אחת. עכשיו, להעביר את כל התוכן המסומן לתוך צינור אחד ולייבש את הפפטידים המסומנים.
לאחר שחזור הדגימות בחומצה פורמית של 0.1%, פתחו את הדגימה האוטומטית של NanoLC, והכניסו את הדגימות לתוך הדגימה האוטומטית. לאחר הדגימות הונחו בדגימה האוטומטית, חשוב להגדיר את הפרמטרים הנכונים עבור כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית מסה. כאן, אנו מתארים את הפרמטרים הן עבור כמות ללא תוויות והן עבור כימות מבוסס iTRAQ באמצעות LC-MS.
במקרה של כמות ללא תוויות, מעבר צבע של 120 דקות שימש כדגימה אחת לא מנוצלת מוזרקת. משך זמן זה ניתן להגדיל או להקטין בהתבסס על המורכבות המדגם. בניסוי זה, זרימה של 300 ננו-liter לדקה נקבעה עם השיפוע הבא עבור פתרון B, שהוא 80% acetonitrile ב 1%חומצה פורמית, במקרה זה.
באותו אופן, אנחנו יכולים להגדיר הדרגתי לניסוי iTRAQ. מאחר שהדגימות אינן מופרות, נעשה שימוש במעבר צבע של 90 דקות. ניתן לראות כאן את הפרמטרים של MS עבור כימות ללא תוויות, כמו גם כימות מבוסס תווית iTRAQ.
השלב הראשון כרוך בהגדרת מצב היישום על-ידי לחיצה על הפרמטרים הכלליים. בחרו במצב פפטיד והגדירו את משך פעולת השירות לפי מעבר הצבע של LC הנמצא בשימוש. הגדר את פרמטרי הסריקה עבור הניסוי.
בלחיצה על האפשרות MS-OT, הפרמטרים הופכים גלויים. סוג הגלאי בשימוש מוגדר Orbitrap. האפשרות האחרת הזמינה במכשיר זה כוללת מלכודת יונים.
הרזולוציה הוגדרה ל- 60,000, וניתן לבחור בין אפשרויות שונות הזמינות, בהתאם לצורך ולסוג הניסוי. טווח המסה הוא נורמלי, וטווח הסריקה מוגדר בין 375 ל-1700. הפרמטרים האחרים הם ברירת המחדל עבור יישום MS.
סף האינטנסיביות נקבע, ומצב הטעינה נקבע בטווח של שניים עד שישה. אי-הכללה דינמית נקבעה ל-40 שניות, והסובלנות ההמונית נשמרה ל-10. ערכת הפרמטרים הבאה כוללת את הפרמטרים MS-MS.
מצב הבידוד נבחר עם quadrupole, חלון בידוד מוגדר בשתיים, היסט בידוד הוגדר כבוי, וסוג ההפעלה הוא בדרך כלל HCD לניסוי proteomics. אנרגיית התנגשות יכולה להיות קבועה, או שניתן לסייע בה. דגימות מסומנות דורשות אנרגיות התנגשות גבוהות יותר, ולכן, עבור ניסויי iTRAQ, מומלץ כי אנרגיית ההתנגשות להיות מוגדרת 35, בעוד עבור ניסויי LFQ, זה יכול להיות מוגדר 30.
סוג הגלאי המשמש כאן הוא Orbitrap. מצב טווח סריקה יהיה אוטומטי. הפרמטרים האחרים הם ברירת המחדל לניסויי iTRAQ וניסוי כמותי ללא תוויות.
לחיצה על הסיכום תספק סקירה כללית של כל הפרמטרים LC ו- MS המשמשים לניסוי. אתה יכול להעיף מבט על כל פרמטר ולעשות את ההגהה. לאחר שזה נעשה, ואז לחץ על הקובץ ולשמור אותו כקובץ שיטה.
לאחר השמירה, אז אתה יכול להפעיל את השיטה, ואתה תקבל את הקבצים הגולמיים. ואז ניתן לנתח את הקבצים הגולמיים האלה באמצעות תוכנת Proteome Discoverer. איור זה מציג את כיסוי הרצף של BSA בשלושה שכפולים טכניים, שהם 91% בשלושת המשכפלים.
זה מציין את יכולת הרבייה של המכשיר. עכשיו, נתון זה מראה את האחידות במספר הגפרורים הספקטרליים הפפטידים, הפפטידים והחלבונים שזוהו בשלוש דגימות ביולוגיות שונות, אשר, שוב, נותן מושג על רבייה של המכשיר. כאן, דיאגרמת ון מייצגת את החלבונים הנפוצים והבלעדיים שזוהו בשלוש דגימות שונות בניסוי ללא תוויות וניסוי מבוסס תוויות.
תרשימי עמודות אלה מציגים את מספר הגפרורים הספקטרליים הפפטידים, קבוצות הפפטידים, סך החלבונים, קבוצות החלבון ומספר החלבון לאחר 1%FDR, שזוהו בניסוי LFQ ו- iTRAQ. פרוטאומייקה של רקמות של דגימות ביולוגיות מאפשרת לנו לחקור סמנים ביולוגיים פוטנציאליים חדשים הקשורים לשלבים שונים של התקדמות המחלה. הפרוטוקול המתואר לניתוח פרוטאומי כמותי של רקמות מספק נתוני כיסוי טובים לשחזור.
שימוש בשכפולים טכניים מבטיח יכולת רבייה טובה, גם אם הדגימות מופעלות בנקודות זמן שונות. כאן, הראינו את הניתוח של דגימות רקמה באמצעות שתי שיטות כמות: ללא תווית ופרוטומיה מבוססת תווית. בחירת טכניקות פרוטאומיות כמותיות עשויה להיות תלויה במספר הדגימות, הזמינות של פלטפורמות MS ושאלה ביולוגית שיש לטפל בהן.
