ברצוננו להודות למכון הלאומי להזדקנות (K99/R00 AG055683 ל-JMR), למכון ג'ורג' ואן ריאן למדעי המוח (EP, GC, JMR), למכללה לרוקחות באוניברסיטת רוד איילנד (EP, GC, JMR) ול-Konung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). אנו מודים לדוקטורנטית רבקה סנפט, בהכשרתה עם פרופ' סוזן דימצקי, המחלקה לגנטיקה, בית הספר לרפואה של הרווארד, על שהכירה לנו את שיטת הציפה החופשית. חלק מהתמונות ששימשו באיור 1 התקבלו ממקורות "חופשיים לשימוש, לשיתוף או לשינוי, אפילו מסחריים": עכבר ושפופרת מיקרוצנטריפוגה (Pixabay), מוח עכבר (Jonas Töle, Wikimedia Commons), אזור מוח קריוסטט ועכבר (מרכז DataBase למדעי החיים, ויקישיתוף), מיכל זכוכית (OpenClipart, FreeSvg.org) ומיקרוסקופ (Theresa Knott, Open Clip Art Library).

1. הכנת רקמות להקפאה
<ol><li>הטמיעו רקמות קבועות בתבנית הטבעה מתאימה (ראו טבלת חומרים) ליצירת גוש דגימה באמצעות מטריצת דגימות מתאימה (ראו טבלת חומרים) והקפיאו על קרח יבש. אחסנו את גושי הדגימה בטמפרטורה של -80°C עד שהם מוכנים לחתוך. הערה: רקמות קבועות מוכנות בדרך כלל על ידי ניקוב מכרסמים בוגרים (בני 2.5 עד 30 חודשים) זכרים או נקבות (עכבר או חולדה)34, בהתאם להיתר אתי זמין, עם קיבוע מתאים (למשל 10% פורמלין), ואחריו רקמות לאחר קיבוע באותו קיבוע במשך 12 שעות ב 4 מעלות צלזיוס, שטיפת רקמות שלוש פעמים עם PBS 1x, והנחת רקמות ב-15% ולאחר מכן 30% סוכרוז ב-1x PBS למשך הלילה או עד שהרקמות שוקעות35. חוקרים עשויים לנסות להתאים את הפרוטוקול הכללי הזה לשלבי התפתחות שונים.</li>
</ol>2. Cryosectioning
<ol><li>כאשר מוכנים לחתך, אקלום דגימות בהקפאה לפחות 1-2 שעות לפני החתך כדי למנוע ריסוק של רקמה.</li>
	<li>בעזרת הקפאה, חותכים רקמות למקטעים (20-50 מיקרומטר) ואוספים פנימה 6 או 12 תוספות באר (ראה טבלת חומרים) מלאות בתמיסת PBS אחת. הערה: בהתאם לעובי המקטע, כמות הרקמה שיש לאסוף ומספר תוספות הבאר בהן נעשה שימוש, כל באר תכיל מספר משתנה של חתכים המשתרעים על פני כ-10 עד 40 פרוסות לבאר. לדוגמה, אם מוח שלם נחתך ב-40 מיקרומטר, ייאספו כ-18-24 מקטעים בכל באר באמצעות תוספות של 12 בארות. כמו כן, חתכים של 20 מיקרומטר יכולים להיות מעט מאתגרים לטיפול, ולכן 40 מיקרומטר מומלץ לצביעה בתפזורת (ראה דיון).</li>
</ol>3. אחסון חלקים
<ol><li>לאחר האיסוף, לשטוף את החלקים עם 1x PBS מוכן טרי במשך 5 דקות. חזור על הפעולה 3 פעמים.</li>
	<li>מעבירים את החלקים לצינורות מיקרוצנטריפוגות של 2 מ"ל מלאים בתמיסת אחסון של 1-1.5 מ"ל (עבור 250 מ"ל, מערבבים 70 גרם סוכרוז, 75 מ"ל אתילן גליקול, ומביאים לנפח עם חיץ פוספט 0.1 M).</li>
	<li>יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד להכנה לצביעה.</li>
</ol>4. יום הכתמה I
<ol><li>מוציאים את הדגימות מהמקפיא ומאזנים אותן בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 - 20 דקות.</li>
	<li>יוצקים חלקים לתוך באר להכניס צלחת 6 באר כדי להפריד פתרון אחסון מקטעים.</li>
	<li>העבירו את הכנסת הבאר לבאר אחרת המכילה כ-6 מ"ל של 1x TBS. שטפו 3 פעמים עם 1x TBS במשך 5 דקות כל אחת בשייקר מסלול במהירות נמוכה ב-RT.</li>
	<li>בזמן שהמקטעים שוטפים, הכינו 7 מ"ל (לדגימה) של תמיסה חודרת-חוסמת המורכבת מ-1x TBS עם 0.3% Triton X-100 ו-3% סרום רגיל (למשל, נסיוב סוסים רגיל). חסום קטעים למשך 30 דקות ב- RT בשייקר מסלולי, תוך שימוש במהירות נמוכה. הערה: חסימה באמצעות סרה מונעת קשירה לא ספציפית של נוגדנים לרקמות או קולטני Fc לא ספציפיים – מומלץ להשתמש בסרום התואם את מין הנוגדן המשני, אך אם אינו זמין, ניתן להשתמש בכל סרום רגיל ממין שונה מהחיה המארחת של הנוגדנים הראשוניים. חומר הניקוי Triton X-100 מאפשר חדירת נוגדנים טובה יותר על ידי חדירת הרקמה.</li>
	<li>הכינו 1 מ"ל לכל דגימה של תמיסת נוגדנים ראשונית המורכבת מנוגדנים ראשוניים נבחרים (מדוללים כראוי) ב-1x TBS עם 0.3% Triton X-100 ו-1% סרום רגיל (ראו שלב 4.4 הערה). מעבירים קטעים מבאר מוכנסים לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל המכיל תמיסת נוגדנים ראשונית כדי להיקשר לאנטיגן(ים) המעניין. הערה: ניתן להשתמש במספר נוגדנים ראשוניים (שנוצרו במינים מארחים שונים).</li>
	<li>מניחים צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל עם חלקים על מיקסר מסתובב במהירות נמוכה (למשל, מהירות 7 סל"ד) ודגרים למשך לילה במשך 12-16 שעות ב-4°C.</li>
</ol>5. יום הצביעה II
<ol><li>למחרת, יוצקים חלקים לתוך באר להכניס צלחת 6 באר כדי להפריד חלקים מתמיסת נוגדנים ראשונית. הערה: ניתן לאסוף תמיסת נוגדנים ולעשות בה שימוש חוזר; הוסף 0.02% (w/v) נתרן אזיד כדי לעכב צמיחה מיקרוביאלית.</li>
	<li>יש לכבס את המקטעים 3 פעמים עם 1x TBS ב-RT (30 שניות עבור 2 השטיפות הראשונות ו-10 דקות עבור השטיפה הסופית).</li>
	<li>הכינו 1 מ"ל לכל דגימה של תמיסת נוגדנים משנית המורכבת מנוגדן משני מתאים (מדולל בהתאם) ב-1x TBS עם 0.3% Triton X-100 ו-1% סרום רגיל (תמיסת מגן מפני אור). הערה: תיוג עקיף עם נוגדן משני מצומד מגביר את האות ומאפשר הדמיה קולורימטרית או פלואורסצנטית של מטרת החלבון.</li>
	<li>העברת קטעים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל המכיל תמיסת נוגדנים משנית. יש לדגור במשך שעתיים ב-RT על שייקר מסלולי, תוך שימוש במהירות נמוכה (תמיסת מגן מפני אור).</li>
	<li>יוצקים חלקים לתוך באר להכניס צלחת 6 באר כדי להפריד חלקים מתמיסת נוגדנים משנית.</li>
	<li>כדי להמשיך להגן על הדגימות מפני אור, שטפו פעמיים עם 1x TBS במשך 30 שניות ב-RT. לאחר מכן שטפו במשך 15 דקות בכף אחת, הוסיפו DAPI (1-0.1 מיקרוגרם/מ"ל) אם רוצים.</li>
</ol>6. הרכבה
<ol><li>יוצקים חלקים לתוך תא היסטולוגי זכוכית, מלבני מלא שלושה רבעים עם 1x TBS.</li>
	<li>השקיעו שקופית זכוכית ב-1x TBS והשתמשו במברשת צבע עדינה כדי לשדל את המקטעים לכיוון השקופית.</li>
	<li>הקש בעדינות על המקטעים על השקופית, וודא שאין קמטים או קפלים.</li>
	<li>חזור על הפעולה עד שכל המקטעים יוטענו בשקופיות. הערה: כאשר מוח שלם, למשל, נחתך ב 40 מיקרומטר, נאסף ב 12 תוספות באר עם aliquot אחד המכיל 18-24 חלקים; פרוסות מותקנות בדרך כלל על 1-2 שקופיות, אך ניתן גם להרכיב פחות מקטעים בכל שקופית, בהתאם להעדפת החוקר.</li>
</ol>7. כיסויים
<ol><li>לאחר ייבוש המקטעים על המגלשה(ים), כ-10-15 דקות ב-RT או עד שהמקטעים נראים אטומים (זכרו להגן על שקופיות מפני אור), מרחו אמצעי הרכבה מימי מתאים (התקשות או אי-התקשות). אנטי-דהייה עדיפה אם משתמשים בנוגדן משני מצומד פלואורסצנטי. הערה: איכות הפלואורסצנטיות עשויה להיות פחותה בעת שימוש באמצעי הרכבה מתקשה, אך שקופיות אמורות להחזיק מעמד זמן רב יותר.</li>
	<li>בעזרת פינצטה, מניחים כיסוי על גבי המדיום. כסו בנייר סינון ולחצו בחוזקה כלפי מטה כדי להסיר אמצעי הרכבה עודפים. הערה: אם אתם משתמשים בתושבת שאינה מתקשה, צבעו את קצוות השקופית המכוסה בלק שקוף לאיטום.</li>
	<li>קטעי תמונה באמצעות מיקרוסקופ מתאים. יש לאחסן בקופסת שקופיות חשוכה בטמפרטורה של 4°C. הערה: ניתן לצלם מקטעים באמצעות מגוון מיקרוסקופים, כגון סריקת לייזר פלואורסצנטית קונפוקלית והפוכה או זקופה, בהגדלות (למשל, 10x, 20x, 40x) בהתאם לצרכי החוקר.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Childs, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathobiology+of+Human+Disease.+Part+IV:+Techniques+in+Experimental+Pathology.">Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Properties+of+an+Antibody+Containing+a+Fluorescent+Group.">Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group.</a> Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>Goldman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies:+indispensable+tools+for+biomedical+research.">Antibodies: indispensable tools for biomedical research.</a> Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).</li><li>Taylor, S. N., Harlow, E. D., Lane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Antibodies:+A+Laboratory+Manual.">Using Antibodies: A Laboratory Manual.</a> The Quarterly Review of Biology. 74 (3), 374 (1999).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Hermersd&#246;rfer, H., Beesley, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunocytochemistry. A Practical Approach. 38 (3), 348-348 (1994).</li><li>Schacht, V., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basics+of+Immunohistochemistry.">Basics of Immunohistochemistry.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Review+of+Cytology.">International Review of Cytology.</a> International Review of Cytology. 5, 1-23 (1956).</li><li>Mepham, B. L., Britten, K. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunostaining+Methods+for+Frozen+and+Paraffin+Sections.">Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections.</a> Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).</li><li>Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+immunohistochemistry.">Applications of immunohistochemistry.</a> Journal of Pharmacy &amp; Bioallied Sciences. 4, 307-309 (2012).</li><li>Li, A., Yang, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Molecular+Biology.">Methods in Molecular Biology.</a> Methods in Molecular Biology. 2108, 43-55 (2020).</li><li>H&#246;kfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Immunohistochemistry+to+Studies+on+Monoamine+Cell+Systems+with+Special+Reference+To+Nervous+Tissues.">Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).</li><li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+transcriptomic+and+anatomic+atlas+of+mouse+dorsal+raphe+Pet1+neurons.">A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Physiological+Approach+to+Perfusion-Flxation+of+Tissues+with+Formalin.">A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin.</a> Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fixatives+for+immunostaining.">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).</li><li>van der Loos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+focus+on+fixation.">A focus on fixation.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 82 (3), 141-154 (2007).</li><li>Canene-Adams, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+for+immunohistochemistry.">Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry.</a> Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+freely+floating+fixed+tissue+sections.">Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections.</a> Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).</li><li>Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Fos:+rapid+protocols+for+single-+and+double-labeling+c-Fos+immunohistochemistry+in+fresh+frozen+brain+sections.">Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).</li><li>Bertheau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+of+immunohistochemical+reactivity+on+stored+paraffin+slides.">Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides.</a> Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).</li><li>Blind, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenicity+testing+by+immunohistochemistry+after+tissue+oxidation.">Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation.</a> Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).</li><li>Desmet, V. J., Krstulovi&#263;, B., Damme, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+study+of+rat+liver+in+alpha-naphthyl+isothiocyanate+(ANIT)+induced+cholestasis.">Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis.</a> The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).</li><li>Bulmer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Histochemistry+of+Ovarian+Macrophages+in+the+Rat.">The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat.</a> Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).</li><li>L&#246;nnerholm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+Demonstration+of+Carbonic+Anhydrase+Activity+in+the+Human+Kidney.">Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).</li><li>Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Immunohistochemistry+for+Gonadotropin-Releasing+Hormone+(GnRH)+and+Pro-GnRH,+and+in+Situ+Hybridization+for+GnRH+Messenger+Ribonucleic+Acid+in+Rat+Brain.">Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain.</a> Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).</li><li>Nadelhaft, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sessile+drop+method+for+immunohistochemical+processing+of+unmounted+sections+of+nervous+tissue.">The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).</li><li>Wainer, B. H., Rye, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+horseradish+peroxidase+tracing+combined+with+localization+of+choline+acetyltransferase+immunoreactivity.">Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).</li><li>Piekut, D. T., Casey, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+of+immunoreagents+in+Vibratome-sectioned+brain:+a+light+and+electron+microscopic+study.">Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).</li><li>Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-containing+gabaergic+interneurons+in+the+rat+neostriatum.">Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum.</a> The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).</li><li>Kjell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+Imatinib+Treatment+for+Acute+Spinal+Cord+Injury:+Functional+Recovery+and+Serum+Biomarkers.">Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers.</a> Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).</li><li>Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+transport+and+Parkin-independent+degeneration+of+respiratory+chain-deficient+dopamine+neurons+in+vivo.">Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).</li><li>Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cryoprotectant+to+maintain+long-term+peptide+immunoreactivity+and+tissue+morphology.">Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology.</a> Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).</li><li>Estrada, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Long-Term+Cryostorage+of+Brain+Tissue+Sections+for+Quantitative+Histochemistry.">Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+preparation+of+cryosections+for+immunocytochemistry.">On the preparation of cryosections for immunocytochemistry.</a> Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).</li><li>Capelozzi, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papel+da+imuno-histoqu&#237;mica+no+diagn&#243;stico+do+c&#226;ncer+de+pulm&#227;o.">Papel da imuno-histoqu&#237;mica no diagn&#243;stico do c&#226;ncer de pulm&#227;o.</a> Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunocytochemistry. , 65-77 (2009).</li><li>Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+combining+RNAscope+in+situ+hybridization+with+immunohistochemistry+in+thick+free-floating+brain+sections+and+primary+neuronal+cultures.">A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures.</a> PloS one. 10 (3), 0120120 (2015).</li><li>Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroanatomical Tract-Tracing Methods. , 207-262 (1981).</li><li>Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cresyl+violet:+A+red+fluorescent+Nissl+stain.">Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).</li></ol>

אין מה לחשוף

אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקה רב-תכליתית שהפכה לחיונית בזיהוי ביטוי חלבונים ולוקליזציה בתוך חלקי רקמות. בדיקה זו משמשת ברחבי הקהילה המדעית כדי להבין עוד יותר מאפיינים של רקמה משלבים של תפקוד תקין למצבי מחלה. IHC מועסק במגוון תחומים, החל מאבחון קליני של מחלות כגון סרטן ועד תגליות ראשוניות...

Immunostaining היא פרקטיקה מחקרית פופולרית שהחלה לפני 130 שנה עם גילוי נוגדנים בסרום בשנת 1890 על ידי Von Behring1. בתחילת המאהה-20 הוצמדו צבעים לאנטיגנים ומאוחר יותר לנוגדנים כדרך לכמת ולדמיין תגובות1, ובשנת 1941 פיתח אלברט קונס את תוויות הנוגדנים הפלואורסצנטיות הראשונות, תגלית שחוללה מהפכה במיקרוסקופ אור 2,3. המונח "immunostaining" מקיף טכניקות רבות שפותחו באמצעות עיקרון זה, כולל כתם מערבי, ציטומטריית זרימה, ELISA, אימונוציטוכימיה ואימונוהיסטוכימיה 3,4. כתם מערבי מזהה נוכחות של חלבונים ספציפיים מתמציות רקמות או תאים5. חלבונים מופרדים לפי גודל באמצעות אלקטרופורזה בג'ל, מועברים לקרום ונבדקים באמצעות נוגדנים. טכניקה זו מצביעה על נוכחות של חלבון וכמה חלבון קיים; עם זאת, הוא אינו חושף מידע על לוקליזציה של החלבון בתוך תאים או רקמות. שיטה אחרת, אימונוציטוכימיה (ICC), מסמנת חלבונים בתוך תאים, בדרך כלל תאים המעובדים במבחנה. ICC מראה הן ביטוי חלבונים והן לוקליזציה בתוך תאים6. כדי לזהות ולדמיין חלבון מסוים ברמת הרקמה, נעשה שימוש באימונוהיסטוכימיה (IHC).
IHC היא שיטה שחוקרים משתמשים בה כדי להתמקד באנטיגנים ספציפיים בתוך רקמות, תוך ניצול התכונות הכימיות של מערכת החיסון 7,8. על ידי יצירת נוגדנים ראשוניים ומשניים ספציפיים הקשורים לאנזים או לצבע פלואורסצנטי, אנטיגנים בעלי עניין יכולים להיות מסומנים ומתגלים ברוב הרקמות (כפי שנסקר ב- Mepham ו- Britten)9. המונח "אימונוהיסטוכימיה" כשלעצמו אינו מפרט את שיטת הסימון המשמשת לחשיפת האנטיגן המעניין; לפיכך, מינוח זה משולב לעתים קרובות עם טכניקת הזיהוי כדי להגדיר בבירור את שיטת התיוג: אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית (CIH) כדי לציין מתי הנוגדן המשני מצומד לאנזים, כגון פרוקסידאז; או IHC פלואורסצנטי כדי לציין מתי הנוגדן המשני מצומד לפלואורופור, כגון פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) או טטרמתילרודאמין (TRITC). הסלקטיביות של IHC מאפשרת לרופאים ולחוקרים לדמיין ביטוי ופיזור חלבונים ברקמות, במצבי בריאות ומחלות שונים10. בתחום הקליני, IHC משמש בדרך כלל לאבחון סרטן, כמו גם לקביעת הבדלים בסוגים שונים של סרטן. IHC שימש גם כדי לאשר סוגים שונים של זיהומים מיקרוביאליים בגוף, כגון הפטיטיס B או C11. במחקר ביו-רפואי, IHC משמש לעתים קרובות למיפוי ביטוי חלבונים ברקמות והוא חשוב בזיהוי חלבונים חריגים הנראים במצבי מחלה. לדוגמה, ניוון עצבי מלווה לעתים קרובות בהצטברות של חלבונים חריגים במוח, כגון פלאקים Αβ וסבכים נוירופיברילריים במחלת אלצהיימר. מודלים של בעלי חיים מפותחים לעתים קרובות כדי לחקות מצבים פתולוגיים אלה, ו-IHC היא שיטה אחת שבה משתמשים החוקרים כדי לאתר ולכמת את החלבונים המעניינים 10,12,13. בתורו, אנו יכולים ללמוד יותר על הגורמים למחלות אלה, ואת הסיבוכים המתעוררים איתם.
ישנם שלבים רבים הכרוכים בביצוע IHC. ראשית, רקמת העניין נאספת ומוכנה להכתמה. ניתן לטעון שרוב החוקרים מכינים דגימות רקמה קבועות, כאשר זילוח של הקיבוע באמצעות מערכת הדם הוא אופטימלי מכיוון שהוא משמר מורפולוגיה14,15. ניתן להשתמש גם לאחר קיבוע של דגימות רקמה אך עשוי להניב תוצאות פחות מאידיאליות16. קיבוע צולב, כגון פורמלדהיד, פועל על ידי יצירת קשרים כימיים בין חלבונים ברקמה17. לאחר מכן פורסים רקמות קבועות לשכבות או מקטעים דקים מאוד באמצעות מיקרוטום, כאשר חוקרים רבים מעדיפים לאסוף חלקים קפואים באמצעות הקפאה. משם הרקמה נאספת ומורכבת ישירות על מגלשת מיקרוסקופ (שיטת החלקה על החלקה), או תלויה בתמיסה (שיטת ציפה חופשית), כגון מלח חוצץ פוספט (PBS)18. שיטת האיסוף בה נעשה שימוש נקבעת מראש על פי צרכי החוקר, כאשר כל אחת משתי שיטות אלה מציגה יתרונות וחסרונות משלה.
השיטה המותקנת בהחלקה היא ללא ספק הנפוצה ביותר, כאשר יתרון חשוב הוא שניתן להכין חלקים דקים מאוד (10-14 מיקרומטר), מה שחשוב, למשל, לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון. יש גם טיפול מינימלי בדגימה, מה שמקטין את הנזק הפוטנציאלי לשלמות המבנית של הרקמה19. חוקרים משתמשים לעתים קרובות בטכניקה זו עם רקמה קפואה טרייה (רקמה שמוקפאת מיד באמצעות קרח יבש, איזופנטאן וכו '), שהיא עדינה מאוד בהשוואה לרקמה קבועה ויש לנקוט בזהירות רבה כדי למנוע הפשרה של הדגימה. יתרון נוסף של שימוש בחלקים המותקנים על שקופיות הוא שבדרך כלל אין צורך בכמויות גדולות של פתרונות לצביעה4. לכן, חוקרים יכולים להשתמש בכמות קטנה יותר של נוגדנים יקרים או כימיקלים אחרים כדי להשלים את הכתם. בנוסף, ניתן להעלות קטעים ממספר קבוצות ניסוי שונות על אותה שקופית, מה שיכול להיות יתרון, במיוחד במהלך רכישת תמונה. מצד שני, ישנם כמה חסרונות בשימוש במקטעים המותקנים על שקופיות, ובראשם שקטע הרקמה מוצמד לשקופית ובכך מגביל את חדירת הנוגדנים לצד אחד של המקטע, מה שמגביל את עובי הקטע ואת הייצוג התלת ממדי של הרקמה. זה יכול לקרות גם כי במהלך שטיפות, הקצוות של הרקמה וחלקים שלמים עשויים להתנתק מן השקופית, מה שהופך את הניסוי כולו חסר תועלת. יתר על כן, IHC בדרך כלל צריך להתבצע במהירות יחסית בעת שימוש בגישה המותקנת על שקופיות כדי למנוע השפלה של אפיטופ האנטיגן 20,21 עם שקופיות לא מעובדות המאוחסנות בדרך כלל ב -20 או -80 ° C, לעתים קרובות מכוסה ומאוחסן אופקית או בתיבות שקופיות, וכתוצאה מכך טביעת רגל אחסון גדולה יחסית. לבסוף, טכניקת ההרכבה על שקופיות יכולה גם לקחת זמן רב אם החוקרים צריכים לטפל במספר רב של שקופיות כדי לעבד מספר גדול של קטעי רקמות.
בשל חלק מהאתגרים הללו באמצעות שיטת ההרכבה על השקופיות, שינוי שנקרא שיטת הציפה החופשית הפך לחלופה פופולרית. טכניקה זו נכנסה לספרות בשנות ה-60-70 22,23,24, צברה פופולריות בשנות ה-80 25,26,27,28,29, וכיום היא שיטה מבוססת היטב הכוללת ביצוע הכתם על הקטעים שנאספו בהשעיה ולא היצמדה לשקופית 12,30,31 . שיטת הציפה החופשית אינה מומלצת כאשר קטעי הרקמה הם פחות מ -20 מיקרומטר; עם זאת, מניסיוננו זוהי הגישה הנבחרת כאשר חלקים עבים יותר (40-50 מיקרומטר) להיות מוכתם. יתרון מובהק אחד הוא שנוגדנים יכולים לחדור חלקים צפים חופשיים מכל הזוויות וליצור פחות צביעת רקע הודות לשטיפה יעילה יותר, כל זאת וכתוצאה מכך איתות טוב יותר בעת ההדמיה. בנוסף, החלקים מותקנים על השקופיות לאחר העיבוד, ובכך מבטלים את האפשרות של ניתוק רקמות, כמו גם מפחיתים את הזמן התופס את ההקפאה. שיטת הציפה החופשית יכולה גם להיות הרבה פחות אינטנסיבית עבודה, במיוחד עבור מחקרים ביו-רפואיים בקנה מידה גדול. למשל, ניתן להכתים חלקים רבים (18-40) מאותה דגימה יחד באותה באר, מה שחוסך זמן בביצוע שלבי השטיפה והדגירה של הנוגדנים. יתר על כן, מכיוון שניתן להרכיב מספר גדול יותר (12-16) של מקטעים בכל שקופית באמצעות גישה זו, לעתים קרובות נוח ומהיר יותר לחוקר להציג ולצלם קטעים. יש לציין כי במהלך הרכבה של פרוסות רקמות על השקפים, ניתן לחבר ולנתק חלקים עד לקבלת הכיוון הרצוי. החוקרים גם משתמשים לעתים קרובות בריכוזים מעט נמוכים יותר של נוגדנים בשיטת הציפה החופשית, ומכיוון שהדגירות מבוצעות בצינורות מיקרוצנטריפוגות, ניתן לאסוף את הנוגדנים בקלות ולשמר אותם עם נתרן אזיד לשימוש חוזר (ראה שלב 5.1). יתרון נוסף הוא שניתן לאחסן את המקטעים ישירות ב -80 מעלות צלזיוס בצינורות מיקרוצנטריפוגות קטנות עם תמיסה קריופרוטקגנטית32, ובכך למזער את שטח האחסון ולמקסם את תוחלת החיים של הדגימות33. החיסרון בשימוש בטכניקה זו הוא שהקטעים מטופלים הרבה, ולכן הם נוטים לפגוע. עם זאת, ניתן להקל על כך על ידי שימוש בטלטול נמוך ובמהירויות סיבוב נמוכות, כמו גם הכשרה נכונה של החוקרים כיצד להעביר את הדגימות ולהרכיב את המקטעים על השקפים.
יחד, IHC הוא כלי מבוסס וחיוני להדמיה וללוקליזציה של ביטוי חלבונים הן בתחום המחקר הקליני והן בתחום המחקר הביו-רפואי. IHC צף חופשי היא שיטה יעילה, גמישה, כמו גם כלכלית, במיוחד בעת ביצוע מחקרים היסטולוגיים בקנה מידה גדול. כאן, אנו מציגים פרוטוקול IHC פלואורסצנטי אמין וצף חופשי עבור הקהילה המדעית שניתן להתאים בהתאם לכתמים כרומוגניים של IHC וכתמים אחרים כגון המטוקסילין ואאוסין או צביעה סגולה קרזיל.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding molds</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF98-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide boxes</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>71370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td>24 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular staining dish</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>70312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round artist paintbrush #2</td>
			<td>Princeton Select Series</td>
			<td>3750R</td>
			<td>Brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen matrix for embedding</td>
			<td>OCT Tissue-Tek, Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain tray &#8211; slide staining system</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>71396-B</td>
			<td>Use dark lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Micro Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield antifade mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Non-hardening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well inserts for 12-well plates</td>
			<td>Corning Netwells</td>
			<td>3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well inserts for 6-well plates</td>
			<td>Corning Netwells</td>
			<td>3479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>WHA1440042</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

histological-based stainings using free-floating tissue sections

אימונוהיסטוכימיה היא טכניקה נפוצה לדמיין מבני רקמות ספציפיים, כמו גם ביטוי חלבונים ולוקליזציה. שתי גישות חלופיות נמצאות בשימוש נרחב לטיפול בקטעי הרקמה במהלך הליך הצביעה, גישה אחת כוללת הרכבה ישירה של החלקים על שקופיות זכוכית, ואילו גישה שנייה, הציפה החופשית, מאפשרת לשמור על חלקים קבועים ולהכתים אותם כשהם תלויים בתמיסה. למרות שגישות המותקנות על שקופיות וצפות חופשיות עשויות להניב תוצאות דומות, טכניקת הציפה החופשית מאפשרת חדירת נוגדנים טובה יותר ולכן צריכה להיות השיטה המועדפת כאשר חלקים עבים יותר ישמשו לשחזור תלת-ממדי של הרקמות, למשל כאשר מוקד הניסוי הוא להשיג מידע על הקרנות דנדריטיות ואקסונליות באזורי מוח. בנוסף, מכיוון שהסעיפים נשמרים בתמיסה, אליציטוט יחיד יכול להכיל בקלות 30 עד 40 חלקים, שהטיפול בהם פחות מייגע, במיוחד במחקרים ביו-רפואיים בקנה מידה גדול. במאמר זה נמחיש כיצד ליישם את שיטת הציפה החופשית על צביעה פלואורסצנטית של אימונוהיסטוכימיה, תוך התמקדות בעיקר במקטעי מוח. נדון גם כיצד ניתן לשנות בקלות את טכניקת הציפה החופשית כך שתתאים לצרכים האישיים של החוקרים ותותאם לרקמות אחרות, כמו גם לכתמים היסטוכימיים אחרים, כגון המטוקסילין ואאוזין וקרסיל סגול, כל עוד דגימות הרקמה קבועות כראוי, בדרך כלל עם פרפורמלדהיד או פורמלין.

התוכנית הכוללת של השימוש בשיטת הציפה החופשית לביצוע בדיקה אימונוהיסטוכימית פלואורסצנטית מודגמת באיור 1. דוגמה מייצגת של IHC פלואורסצנטי המשתמש בשיטת הציפה החופשית במוח עכבר הבוחן ביטוי חלבון גליה פיברילרי חומצי (GFAP) מוצגת באיור 2 בהגדלה נמוכה וגבוהה יותר כ?...

Watch this Scientific Journal Video about Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections at JoVE.com

Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

טכניקת הציפה החופשית מאפשרת לחוקרים לבצע צביעות היסטולוגיות, כולל אימונוהיסטוכימיה על חלקי רקמות קבועים כדי להמחיש מבנים ביולוגיים, סוג התא וביטוי ולוקליזציה של חלבונים. זוהי טכניקה היסטוכימית יעילה ואמינה שיכולה להיות שימושית לחקר מספר רב של רקמות, כגון מוח, לב וכבד.

כתמים היסטולוגיים באמצעות קטעי רקמה צפים חופשיים

Immunohistochemistry is a widely used technique to visualize specific tissue structures as well as protein expression and localization. Two alternative ...

histological-based-stainings-using-free-floating-tissue-sections

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K Views.  University of Rhode Island. טכניקת הציפה החופשית מאפשרת לחוקרים לבצע צביעות היסטולוגיות, כולל אימונוהיסטוכימיה על חלקי רקמות קבועים כדי להמחיש מבנים ביולוגיים, סוג התא וביטוי ולוקליזציה של חלבונים. זוהי טכניקה היסטוכימית יעילה ואמינה שיכולה להיות שימושית לחקר מספר רב של רקמות, כגון מוח, ...

Video: Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

אימונוהיסטוכימיה: מדורים פרפין שימוש ABC Vectastain קיט מ וקטור Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

אימונוהיסטוכימיה על סעיפים פרפין של האפידרמיס עכבר באמצעות נוגדנים פלורסנט

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is determined. Conventional preparation of tissues for PCR-ready DNA often take several hours to days, depending on the tissue sample. The genotype of the sample may thus be delayed for several days, which is not an option for many different types of experiments. Here we demonstrate the complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit. First, we demonstrate the fifteen-minute extraction of DNA from the tissue sample. Then, we demonstrate the real time read-out of the PCR amplification of the sample, which allows for the identification of a positive sample as it is being amplified. Together, the rapid extraction and real-time readout allow for a prompt identification of genotype of a variety different types of tissues through the reliable method of PCR.

The complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, is done in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

Genotyping מהיר של רקמות באמצעות עכבר חלץ-N-Amp רקמות סיגמא של ערכת ה-PCR

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

מערכת culturing איריס תאים פיגמנט אפיתל לחקר התחדשות עדשה של ניוט

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3. On the macro scale the stiffness of tissues and organs within the human body span several orders of magnitude4. Much less is known about how stiffness varies spatially within tissues, and what the scope and spatial scale of stiffness changes are in disease processes that result in tissue remodeling. To better understand how changes in matrix stiffness contribute to cellular physiology in health and disease, measurements of tissue stiffness obtained at a spatial scale relevant to resident cells are needed. This is particularly true for the lung, a highly compliant and elastic tissue in which matrix remodeling is a prominent feature in diseases such as asthma, emphysema, hypertension and fibrosis. To characterize the local mechanical environment of lung parenchyma at a spatial scale relevant to resident cells, we have developed methods to directly measure the local elastic properties of fresh murine lung tissue using atomic force microscopy (AFM) microindentation. With appropriate choice of AFM indentor, cantilever, and indentation depth, these methods allow measurements of local tissue shear modulus in parallel with phase contrast and fluorescence imaging of the region of interest. Systematic sampling of tissue strips provides maps of tissue mechanical properties that reveal local spatial variations in shear modulus. Correlations between mechanical properties and underlying anatomical and pathological features illustrate how stiffness varies with matrix deposition in fibrosis. These methods can be extended to other soft tissues and disease processes to reveal how local tissue mechanical properties vary across space and disease progression.

The stiffness of the extracellular matrix strongly influences multiple behaviors of adherent cells. Matrix stiffness varies spatially throughout a tissue, and undergoes modification in various disease conditions. Here we develop methods to characterize spatial variations in stiffness in normal and fibrotic mouse lung tissue using atomic force microscopy microindentation.

מיקרו מכונות אפיון רקמת הריאה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

השוואה כמותית של Cis-רגולטוריות (Cre) אלמנט פעילות טראנסגנטי תסיסנית melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות תסיסנית רקמה

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is phosphorylated by both receptor and non-receptor tyrosine kinases at tyrosine 1798. Omori et al. developed site- and phosphorylation status-specific antibodies against human girdin at tyrosine-1798 (pY1798), which specifically bind to phosphorylated tyrosine-1798, but not to unphosphorylated tyrosine-1798. pY1798 antibodies have been used to specifically label tuft cells (TCs) that are present in mammalian gastrointestinal tissues, but the function of these cells is unclear. This protocol allows the robust visualization of TCs in the jejunum using pY1798 antibodies and immunofluorescence. To ensure successful and simple TC visualization, this protocol includes two histological techniques: production of free-floating cryosections from gelatin-filled jejunum tissue, and low-temperature antigen retrieval at 50 &#176;C for 3 h. Filling the jejunum with gelatin maintains the shape of free-floating sections throughout the staining procedure, whereas low-temperature antigen retrieval ensures robust signals from TCs. Successful use of this protocol results in pY1798 staining of TCs distributed from villus tip to crypt. Stained TCs have a spool-shaped soma and fluorescent signals condense at the lumenal tip, which corresponds to the protruding &#39;tuft.&#39;&#160;Phalloidin staining colocalized with pY1798-positive TCs at the thickened brush border, and corresponds to a rootlet mass extending from the TC tuft. This protocol could be used to examine TCs in human biopsy samples collected with gastrointestinal endoscopes. Furthermore, TCs were recently reported to accumulate following parasite infection in mice, suggesting that this protocol could have applications for diagnosis of parasite infections in the human gut.

Kuga et al. discovered that phosphorylation-status specific antibodies against the actin binding protein girdin phosphorylated at tyrosine 1798 (pY1798) can be used to label tuft cells (TCs). This protocol allows robust visualization of TCs using immunofluorescent staining of free-floating jejunum cryosections with pY1798 antibodies.

השימוש נוגדנים Anti-פוספו-girdin להמחיש אניץ מעיים בתאי עכבר לתרשים מעי צם Cryosections

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is ...