מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכללה הלאומית לביטחון רפואי ועל ידי מענק מחקר במדעי הבריאות והעבודה למחקר על מחלות עקשניות ממשרד הבריאות, העבודה והרווחה, יפן.

פרוטוקול הניסוי אושר על ידי הוועדה לחקר בעלי חיים של המכללה הלאומית לביטחון רפואי (מס' 16058). בעלי החיים נשמרו על צ'או מעבדה סטנדרטי (CLEA יפן Inc, טוקיו, יפן). חיות המעבדה טופלו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות.
1. איסוף והפרדה של לימפוציטים
הערה: מאז לימפוציטים חייב להיות טרי ולא ניתן לאחסן, הם חייבים להיאסף מעכברושים עבור כל ניסוי. בנוסף, לימפוציטים במעיים טרופיים חייבים להיאסף ישירות מן צינור בית החזה שבו הם מסתובבים. כל ההליכים צפויים להסתיים בתוך 6 שעות, וכל המכשירים, הכפפות והמשטחים נקיים. על מנת לשמור על בעלי החיים במצב יציב מבחינה פיזיולוגית, כל מלוחים ונוזלים אחרים המשמשים בניסוי צריך להישמר חם.
<ol><li>יוצרים צינור קנולציה (בקוטר 1 מ"מ) כמו עקומת הפרין (רדיוס של כ-5 מ"מ) לאחר טבילתו במים חמים (כ-80-90 מעלות צלזיוס) וממקמים אותו ללוח פלסטיק באמצעות סרט הדבקה לכמה שעות מראש.</li>
	<li>הרדמה עכברוש Wistar זכר (8-12 שבועות) עם הזרקה תוך-אישית של תערובת של Midazolam (2mg/kg), Domitor (0.15mg/kg) ו Betulphar (2.5mg/kg) לחתוך את שיער הגוף של הבטן באמצעות קוצץ שיער. הסר את השיער בחוזקה לאחר הגילוח, כך השיער לא נכנס לחלל הבטן.</li>
	<li>לאחר אישור כי עומק יציב של הרדמה הנדרש עבור ההליך מתקבל על ידי קמצוץ בוהן, לבצע חתך עם מספריים כירורגיים אופקית מקו האמצע לאזור subcostal שמאל. היזהר לא לפגוע בכלי הדם בצפק הקודקודי על ידי צפייה בכלי הדם תחת אור.</li>
	<li>לעטוף את הבטן עם גזה רטובה ולהעביר את הבטן בעדינות ימינה מחוץ לגוף כדי לחשוף את האיברים retroperitoneal. הכנס חריץ בין שרירי הזקפה של עמוד השדרה לבין רקמת השומן באמצעות מספריים כירורגיים ולהפריד אותם בבוטות עם האצבעות.</li>
	<li>בזהירות להסיר את רקמת החיבור סביב צינור בית החזה. רקמת החיבור העודפת עולה עם הגיל. לחשוף את צינור בית החזה ממש מתחת לצלב השמאלי של הסרעפת caudally עד אורך 20 מ"מ של צינור בית החזה היה גלוי. הפרד בעדינות הידבקויות בין צינור בית החזה לבין אב העורקים באמצעות פינצטה מדויקת או ספוגיות כותנה רטובות.<ol>
<li>בצע תהליך זה בזהירות כי כמה חולדות יש arterioles הסתעפות מן עורק הבטן חוצה מעל צינור בית החזה או צינור בית החזה קצר בשל מיקום גבוה יותר של מקלעת הלימפה (צינורות בית החזה קטן מתפשט כמו קורי עכביש). הימנע ממגע מיותר לצינור בית החזה כדי למנוע גרימת בצקת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>החל קשירה על ידי מחרוזת (3-0 משי) על צינור בית החזה ממש מתחת לצלב השמאלי של הסרעפת. צינור בית החזה הקאודלי מתרוקן.</li>
	<li>לעשות חור (קוטר 5 מ"מ) בקיר הבטן על ידי דקירת חוד החנית של מספריים כירורגיים, לעבור את צינור הקנול מעוקל סיכת ראש, ו ligate הצינור על שריר iliopsoas בשלב מסוים. ממלאים את צינור הקנולציה בתמיסת מלח רגילה המכילה הפרין 10 U/mL.</li>
	<li>לאחר הנחת מחרוזת (3-0 משי) מתחת לצינור בית החזה המנופח, דקרו את צינור בית החזה עם הקצה החתוך בחדות של צינור קנולציה, קנול אותו לכיוון הזנב כ -5 מ"מ, ו ligate צינור בית החזה עם צינור קנולציה עבור קיבוע.</li>
	<li>כדי לספק מלוחים למניעת התייבשות, ליצור חור (קוטר 3 מ"מ) על הקיר האצילי של antrum של הבטן באמצעות פינצטה מדויקת ולהעביר את צינור הסיליקון (2 מ"מ קוטר) לתריסריון דרך הטבעת pyloric. לאחר תפירת פצע ותחזוקת בעלי החיים בכלובים של בולמן, מתחילים להחדיר מלוחים עמוסי סוכר לתריסריון של כל חולדה מצינור הסיליקון בקצב זרימה של 3 מ"ל / שעה. מכסים את הכלוב כולו במגבת נייר כדי לחמם אותו.</li>
	<li>תקן את צינור הקנולציה לחור במרכז המכסה של צינור חרוט 50 מ"ל על קרח המכיל 6 U / mL הפרין, 10% סרום שור עוברי, ו RPMI 1640 בינוני (pH 7.4; ראה את שולחן החומרים), ולאסוף לימפוציטים צינור בית החזה (TDLs) על קרח. היזהר לא ליצור קשר עם קצה הצינור לקיר הצינור החרוטי כדי למנוע חסימה צינור קנולד עקב היווצרות קריש פיברין בתוך הצינור. נוזל הלימפה (כ 20 מ"ל) כולל כ 1.0 x 108~10 9 לימפוציטים ניתן להשיג ב 6 שעות. כדי להשיג את הלימפוציטים תחת הרדמה מלאה, מישור ההרדמה מנוטר וזרימת הלימפה נצפית כראוי. אותו הרדמה מתווספים באותה מנה כ -3 שעות לאחר חולדות מכניסים לכלוב של בלמן כדי לקבל הרדמה עמוקה ברציפות במשך 6 שעות.</li>
</ol>2. לימפוציטים תיוג עם קרבוקסיפלואורסצין דיאצטט succinimidyl אסתר (CFDSE)
<ol><li>להמיס CFDSE (שולחן החומרים) ב דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ל 15.6 מ"מ (500 מיקרוגרם של CFDSE מומס ב 60 μL של DMSO).</li>
	<li>לימפוציטים דגירה (1 x 108~ 109) ב 50 מ"ל של RPMI 1640 עם 50 μL של פתרון CFDSE במשך 30 דקות ב 37 °C (60 °F) כפי שתואר קודם לכן10.</li>
</ol>3. התקנה ניסיונית למחקרים מיקרו-וסקולריים
<ol><li>הרדמה חולדות המטופל (8-12 שבועות) עם הזרקה תוך-אישית של תערובת של Midazolam (2mg/kg), Domitor (0.15mg/kg), ו Betulphar (2.5mg/kg) ולאשר את עומק ההרדמה על ידי קמצוץ בוהן. הרטב את הבטן לפני טיפוח הפרווה כדי למזער את זיהום השיער. ואז לפתוח את הבטן של החולדה וסטר המטופל באמצעות חתך קו האמצע.</li>
	<li>שים חולדה על צלחת נירוסטה ניידת (כ 120 x 300 מ"מ) עם חור מלבן סביב המרכז מכוסה שקופית זכוכית (24 x 50 מ"מ). בחר כ 10 ס"מ של קטע ileal כולל PPs לתצפית.</li>
	<li>שמור על המעי חם ככל האפשר ולח עם מלוחים אגירה פוספט (PBS) מחומם ל 37 מעלות צלזיוס. להשרות גזה המשמשת לכיסוי המעי הדק עם PBS.</li>
	<li>תוך מתן הרדמה רציפה עם 2 % איזופלורן (ראה טבלה של חומרים), לשים את השקופית על הבמה של המיקרוסקופ ולבחור אזורים מתאימים לתצפית של microcirculation ב PPs שבו כמה HEVs פועלים דרך serosa. PPs טווח בגודל; גדולים יותר מתאימים לתצפית על המיקרו-סירקולציה באמצעות CLSM. המעי הדק אינו ישר במקומות; קטע ישר באורך של לפחות 2 ס"מ ללא כל מתח מתאים לתצפית.</li>
	<li>מכסים את קטע המעיים הסמוך ואת mesentery עם כותנה סופג ספוג PBS. מניחים את קטע המעי בין שני כדורי כותנה מגולגלים וממקמים אותו ככל האפשר מגופו של החולדה כדי למנוע ממנו להיות רטט על ידי פעימות הלב של החולדה ונשימה.</li>
	<li>באמצעות מזרק 1 מ"ל, להזריק לאט (מעל 1 דקות) CFSE שכותרתו TDLs (1 x 108 תאים) לתוך הווריד הצווארי של חולדות הנמען. זריקה תוך ורידי מהירה עשויה להשפיע על זרימת הדם המערכתית.</li>
</ol>4. מיקרו-סירקולציה של לימפוציטים
<ol><li>ניטור רציף TDLs microvasculature של PPs באמצעות CLSM ולהקליט במחשב במשך 3 שעות באמצעות צילום זמן לשגות במרווחי זמן של 30 s. העומק מהסרוסה ל- HEV של PPs הוא כ -25 מיקרומטר, המאפשר תצפית של סטרומה וכלי לימפה נימי לעומק של 30 מיקרומטר.</li>
	<li>הזרק טקסס אדום-dextran (25 מ"ג / קילוגרם) לתוך הווריד הצווארי של כל חולדה המטופל להכתים את זרם הדם Hoechest 33342 (5 מ"ג / קילוגרם) כדי להכתים את גרעיני התא.</li>
	<li>(אופציונלי) לחצו על הלחצן 'קביעות' כדי לכמת את הדינמיקה לימפוציטים, להגדיר לימפוציטים דבקים HEVs יותר מ 30 שניות כמו "לימפוציטים דבק" ולימפוציטים מהגרים מ HEVs כדי סטרומה כמו "'לימפוציטים נודדים". לאחר מכן לחשב את האחוז הממוצע של הגירה (לימפוציטים נודדים / לימפוציטים דבק + לימפוציטים נודדים) לכל שדה ראייה (כ 0.3 מ"מ2).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunity+in+gut+and+lymphoid+cell+trafficking.">Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking.</a> Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).</li><li>Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+control+of+lymphocyte+trafficking:+a+general+overview.">Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview.</a> Immunology. 116, 1-12 (2005).</li><li>Yopp, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptors+regulate+chemokine-driven+transendothelial+migration+of+lymph+node+but+not+splenic+T+cells.">Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells.</a> The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).</li><li>Lucke, S., Levkau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+functions+of+sphingosine-1-phosphate.">Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).</li><li>Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+collection+of+lymph+from+the+liver,+small+intestine,+or+thoracic+duct+of+the+rat.">Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat.</a> The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).</li><li>Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+Intestinal+Lymphoid+Follicles+in+Rat+Peyer's+Patches.">Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).</li><li>Miura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Demonstration+of+Sequential+Migration+Process+of+Lymphocyte+Subpopulations+in+Rat+Peyer's+Patches.">Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).</li><li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cellular+movement+in+vivo+with+photoconvertible+fluorescence+protein+"Kaede"+transgenic+mice.">Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+of+Infected+Peyer's+Patches+Arises+From+Global,+Interferon-Receptor,+and+CD69-independent+Shutdown+of+Lymphocyte+Egress.">Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress.</a> Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).</li><li>Higashiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Selectin-Dependent+Monocyte+Recruitment+Through+Platelet+Interaction+in+Intestinal+Microvessels+of+LPS-Treated+Mice.">P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice.</a> Microcirculation. 15, 441-450 (2008).</li><li>Shirakabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+colitis+through+blocking+lymphopcytes+entry+to+Peyer's+patches+by+sphingosine-1-phosphate+lyase+inhibitor.">Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).</li><li>Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Microscopy:+Visualizing+Immunity+in+Context.">Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Landscape+of+In+Vivo+Immunity:+Insights+from+Dynamic+In+Situ+Imaging+of+Secondary+Lymphoid+Tissues.">Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן תיארנו פרוטוקול לאיסוף לימפוציטים נאיביים במעיים ולהתבוננות בנדידתם בחולדות PPs. הליכים אלה יכולים לחשוף כיצד לימפוציטים לנוע microvasculature של PPs ומאפשרים להשוות חזותית את הדינמיקה שלהם תחת מצב נורמלי או תרופות. התצפית הישירה של דינמיקה זו יש הרבה ערך כדי לקבל רמז לשינוי חיסוני על ידי תרופ?...

הטלאים של פייר (PPs) מורכבים ממאות זקיקי לימפואידים בפרופוריה למינה של המעי הדק. PPs מחולקים זקיקים, האזור interfollicular, ומרכזים נביטה הממוקמים בחלק התחתון של הזקיקים, שם לימפוציטים מגורים על ידי מצגת אנטיגן. אין כלי לימפה afferent, ואת האנטיגנים לפלוש פרופריה למינה מן לומן המעי דרך שכבת תא אפיתל. אזור האפיתל המכסה זקיקי הלימפה נקרא אפיתל הקשורים זקיק, שבתוכו תאי M משולבים מיוחדים ספיגת אנטיגנים ריר. תאי M לוקחים אנטיגנים מהצד הזוהר ואנטיגנים נלכדים לאחר מכן על ידי תאים דנדריטיים ומוצגים לכיוון לימפוציטים נאיביים הזורמים לתוך PPs דרך האנדותל של venules אנדותל גבוה (HEVs)1. PPs לשחק תפקיד חשוב חסינות מעיים קשורים עם השלב המוקדם של דלקת. אינטראקציות מולקולריות רבות כרוכות בכניסה של לימפוציטים לאיברים לימפואידיים משניים (SLOs), כולל מולקולות הידבקות, כימוקינים2,3, ו sphingosine-1-פוספט4; לכן, ישנם מטרות טיפוליות צפויות רבות. לכן, התבוננות בדינמיקה לימפוציטים בתוך PPs מאפשר לנו להציץ בשלב מוקדם מאוד של דלקת ולבחון את התועלת של כמה תרופות מבטיחות.
השיטה כאן מתמקדת בהגירה של לימפוציטים ב PPs, הכולל מספר הליכים (קנולציה לתוך צינור בית החזה5 ואיסוף לימפוציטים ותצפית לטווח ארוך לאחר ההזרקה לתוך לימפוציטים שנאספו). מכיוון שהליכים אלה מורכבים והיה קשה לראות בדיוק כיצד כל הליך בוצע בדוחות קודמים, הזכרנו כאן כמה טיפים להשגת התבוננות מוצלחת. לדוגמה, התבוללות של הצינורות לתוך צינור בית החזה היה קשה מאוד, ואת שיעור ההצלחה הראשונית של קנול היה פחות מ 50%. עם זאת, שיפרנו את השיטה והשגנו שיעור הצלחה העולה על 80%. הזכרנו כמה טיפים אחרים בכתב יד זה הדרושים לתצפית המוצלחת כדי לאפשר הערכה כמותית של הגירה טרנסנדותלאלית של לימפוציטים במספר תנאים.
בדיווחים קודמים, היה קשה להבין את השינויים התלת מימדיים לאורך זמן, כגון הזרקה תוך ורידי של דיו הודו כדי להכתים את מבנה כלי הדם של PPs6, או מיקרוסקופ להיות מונופוקלי7. בשנים האחרונות, שיטה תצפיתית באמצעות כמה בעלי חיים מהונדסים חלבון פלואורסצנטי פוטו-מונברט כגון עכברי קדה הבהירו תנועות תאיות שיטתיות ב vivo8. המחקר השני הבהיר CD69 כיבוי עצמאי של יציאת לימפוציטים מ PPs9. השתמשנו במיקרוסקופיית סריקת לייזר קונפוקלית (CLSM) בגלל היכולת האנליטית הגבוהה שלה. עכשיו אנחנו יכולים בקלות להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה ולהשתמש בהם כדי לנתח את הדינמיקה לימפוציטים.
בדו"ח זה, הדגמנו סדרה של שיטות להערכת נדידת לימפוציטים ב- PPs. ראשית, הראינו שיטות מעודנות של קנול צינור בית החזה כדי לאסוף לימפוציטים. שנית, שיפרנו את שיטות התצפית במספר דרכים לשמירה על איברים אובייקטיביים במידת האפשר תחת השגחה מיקרוסקופית, המאפשרת לנו להשיג תמונות באיכות גבוהה במשך 3 שעות. שלישית, כימתנו את התנועות התאיות של נדידת לימפוציטים כדי להעריך את ההשפעות של תרופות מסוימות. פרוטוקולים מותאמים אלה יתרמו לפיתוח הערכות אימונולוגיה ריר.

<table><tbody><tr><td>A1R+</td><td>Nikon</td><td></td><td>Comfocal Laser Scanning Microscopy</td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Hoechest 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>099-06571</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>GIBCO</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red&amp;ndash;dextran</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1863</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopic observation of lymphocyte dynamics in rat peyer's patches

לימפוציטים נאיביים recirculate מהדם לרקמות הלימפה במצב פיזיולוגי והוא מוכר בדרך כלל כתופעה חשובה בחסינות המעיים. הסטרומה של איברי הלימפה המשניים, כגון טלאים של פייר (PPs) או בלוטות לימפה mesenteric, הם המקום שבו לימפוציטים נאיביים חשים אנטיגנים. לימפוציטים נאיביים מסתובבים במחזור הדם כדי להגיע לצללים אנדותל גבוהים, שער הכניסה ל- PPs. כמה immunomodulators מוערך להשפיע על נדידת לימפוציטים, אבל הערכה מדויקת של דינמיקה microcirculation קשה מאוד, וקביעת שיטה להתבונן נדידת לימפוציטים vivo יכול לתרום בירור המנגנונים המדויקים. אנחנו מעודן השיטה של איסוף לימפוציטים מן צינור הלימפה והתבוננות הדינמיקה המפורטת של לימפוציטים tropic הבטן ב PPs חולדה. בחרנו מיקרוסקופיית סריקת לייזר קונפוקלית כדי לצפות PPs חולדה vivo והקלטנו אותו באמצעות צילום זמן לשגות. עכשיו אנחנו יכולים להשיג תמונות ברורות שיכולות לתרום לניתוח של דינמיקה לימפוציטים.

איסוף לימפוציטים מהלימפה כדי להכין את החולדה לתעלת בית החזה, בצעו חתך בצינור בית החזה המתוח כפי שמוצג באיור 1 ולאחר מכן שמרו את החולדה בכלוב בולמן כפי שמוצג באיור 2.
כאשר לימפוציטים נאספים היטב, אנחנו יכולים להשיג על 20 מ"ל / 6 h נוזל הל...

Watch this Scientific Journal Video about Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches at JoVE.com

Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

כאן, אנו מתארים שיטה מדויקת לאיסוף לימפוציטים צינור בית החזה והתבוננות בהגירה של לימפוציטים טרופיים במדבקות של עכברוש פייר במשך 3 שעות באמצעות צילום זמן לשגות. טכניקה זו יכולה להבהיר כיצד הדינמיקה של לימפוציטים מושפעים בתנאים דלקתיים.

תצפית מיקרוסקופית של לימפוציטים דינמיקה במדבקות של עכברוש פייר

Na&#239;ve lymphocytes recirculate from the blood to the lymphoid tissues under physiological condition and it is commonly recognized as an important ...

microscopic-observation-of-lymphocyte-dynamics-in-rat-peyer-s-patches

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

3.9K Views.  National Defense Medical College. כאן, אנו מתארים שיטה מדויקת לאיסוף לימפוציטים צינור בית החזה והתבוננות בהגירה של לימפוציטים טרופיים במדבקות של עכברוש פייר במשך 3 שעות באמצעות צילום זמן לשגות. טכניקה זו יכולה להבהיר כיצד הדינמיקה של לימפוציטים מושפעים בתנאים דלקתיים.

Video: Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Immunology and Infection

Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense against pathogens. It is well established that Peyer&#39;s patches (PPs) have an essential role in the mucosal immune network by hosting several effector T and B cell subsets. A certain fraction of these effector cells, follicular T helper (TFH) and germinal center (GC) B cells are professionalized in the regulation of humoral immunity. Hence, the characterization of these cell subsets within PPs in terms of their differentiation program and functional properties can provide important information about mucosal immunity. To this end, an easily applicable, efficient and reproducible method of lymphocyte isolation from PPs would be valuable to researchers. In this study, we aimed to generate an effective method to isolate lymphocytes from mouse PPs with high cell yield. Our approach revealed that initial tissue processing such as the use of digestive reagents and tissue agitation, as well as cell staining conditions and selection of antibody panels, have great influence on the quality and identity of the isolated lymphocytes and on experimental outcomes.
Here, we describe a protocol enabling researchers to efficiently isolate lymphocyte populations from PPs allowing reproducible flow cytometry-based assessment of T and B cell subsets primarily focusing on&#160;TFH and GC B cell subsets.

In this study, we present a novel and effective protocol for the isolation of lymphocytes from Peyer&#39;s Patches (PPs), which can be subsequently used for in vivo and in vitro functional assays as well as flow cytometric studies of follicular T helper and germinal center B cells.

שחקני המפתח unraveling Humoral חסינות: מתקדם וממוטב לימפוציט בידוד פרוטוקול טלאים מאתר של Peyer

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense ...

Cancer Research

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Intravital הדמיה של בלוטות לימפה popliteal עכבר

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

וגם בידוד Immunostaining ימפוציטים ותאי דנדריטים מהתיקונים של Peyer Murine

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז&#39;רמינל

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

דגם תא האנדותל מישורי הדמיה החיסוני סינפסה Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements from an experimentally observed displacement field produced by a cell pulling on an elastic substrate. Here, we adapted TFM to investigate the spatial and temporal structure of the force field exerted by B cells when activated by antigen engagement of the B cell receptor. Gel rigidity, bead density, and protein functionalization must be optimized for the study of relatively small cells (~ 6 &#181;m) that interact with, and respond specifically to ligands for cell surface receptors.

Here we present a protocol used to perform traction force microscopy experiments on B cells. We describe the preparation of soft polyacrylamide gels and their functionalization, as well as data acquisition at the microscope and a summary of data analysis.

מיקרוסקופ כוח מתיחה ללמוד B לימפוציטים הפעלת

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...

Bioengineering

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the resolution of peripheral tissue responses. While a variety of methods are used to quantify leukocyte egress from non-lymphoid, peripheral tissues, the cellular and molecular mechanisms that govern context-dependent egress remain poorly understood. Here, we describe the use of in situ photoconversion for quantitative analysis of leukocyte egress from murine skin and tumors. Photoconversion allows for the direct labeling of leukocytes resident within cutaneous tissue. Though skin exposure to violet light induces local inflammatory responses characterized by leukocyte infiltrates and vascular leakiness, in a head-to-head comparison with transdermal application of fluorescent tracers, photoconversion specifically labeled migratory dendritic cell populations and simultaneously enabled the quantification of myeloid and lymphoid egress from cutaneous microenvironments and tumors. The mechanisms of leukocyte egress remain a missing component in our understanding of intratumoral leukocyte complexity, and thus the application of the tools described herein will provide unique insight into the dynamics of tumor immune microenvironments both at steady state and in response to therapy.

Here, we demonstrate the methods for in vivo quantification of leukocyte egress from na&#239;ve, inflamed, and malignant murine skin. We perform a head-to-head comparison of two models: transdermal FITC application and in situ photoconversion. Furthermore, we demonstrate the utility of photoconversion for tracking leukocyte egress from cutaneous tumors.

לכימות ליקוציט היציאה דרך כלי הלימפה מ מאתר עור וגידולים

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...

Biology

Isolation of Lymphocytes from a Mouse Peyer&#39;s Patch

Source: Yazicioglu, Y. F., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58490">Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer&#39;s Patches.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we demonstrate the isolation of lymphocytes from a harvested mouse Peyer&#39;s patch. The isolated lymphocytes can be used for further analysis.

בידוד לימפוציטים ממדבקה של עכבר

Source: Yazicioglu, Y. F., et al. Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer&#39;s ...