Name: biofunctionalization of magnetic nanomaterials
Uploaded: 2020-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biofunctionalization of Magnetic Nanomaterials at JoVE.com

המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי אוניברסיטת המלך עבדאללה למדע וטכנולוגיה (KAUST).

אזהרה: יש להיוועץ תמיד בכל גיליונות נתוני בטיחות החומרים הרלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. השתמש בכל נוהלי הבטיחות המתאימים ובציוד מגן אישי (משקפי בטיחות, כפפות, מעיל מעבדה, מכנסיים באורך מלא, נעליים סגורות). בצע את כל התגובות הביולוגיות במכסה האדים הביולוגי.
הערה: פרוטוקול זה מיועד לייצר 2 x 10 10 NWs/mL ביו-פונקציונליים שווה ערך ל-0.36 מ"ג ברזל/מ"ל המצופים בנוגדנים נגד CD44 עם צפיפות של 3 x10 4 נוגדנים/NW. תחמוצת ברזל-ברזל (מעטפת הליבה) NW הם באורך 2.5 מיקרומטר ויש להם קוטר של 41.5 ננומטר.
1. שחרור ננו-חוטי ברזל
הערה: תהליך הייצור של תחמוצת ברזל / תחמוצת ברזל NW הוסבר בפירוט בפרסום קודם59.
<ol><li>על משטח חיתוך, חתכו את דיסקיות האלומיניום (Al) (איור 2A) לחתיכות קטנות (איור 2B) באמצעות להב קצה יחיד ופטיש קטן כדי להתאים לצינור של 2 מ"ל. השתמשו בפינצטה כדי להעביר את חתיכות האל הקטנות לצינור.</li>
	<li>מלאו את צינור 2 מ"ל, המכיל את חתיכות Al הקטנות, עם 1 מ"ל של 1 M נתרן הידרוקסידי (NaOH). ודא שכל חתיכות Al מכוסות ב- NaOH.</li>
	<li>השאירו את התמיסה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתוך מכסה אדים כימי.</li>
	<li>הסירו רק את חתיכות ה-Al באמצעות הפינצטה ושמרו את ה-NWs (אשכולות שחורים, איור 3A) ששוחררו בתמיסת NaOH למשך 30 דקות נוספות. אל תשנה את פתרון NaOH.</li>
	<li>אספו את ה-NWs על ידי הנחת הצינור בנפח 2 מ"ל במדף מגנטי והמתינו 2 דקות לפני הסרת תמיסת ה-NaOH הישנה בנפח 1 מ"ל. החלף אותו בתמיסת NaOH טרייה.</li>
	<li>סוניק את צינור 2 מ"ל המכיל את NWs במשך 30 שניות ולהשאיר אותו 1 שעה בתוך מכסה אדים כימי.</li>
	<li>חזור על שלבים 1.5-1.6 לפחות ארבע פעמים.</li>
	<li>שטפו את ה-NWs על ידי הנחת הצינור בנפח 2 מ"ל במדף המגנטי והמתינו 2 דקות.</li>
	<li>השליכו את תמיסת NaOH והחליפו אותה ב-1 מ"ל אתנול מוחלט.</li>
	<li>סוניק את הצינור למשך 30 שניות.</li>
	<li>הניחו את הצינור בנפח 2 מ"ל במדף המגנטי והמתינו 2 דקות.</li>
	<li>השליכו את תמיסת האתנול האבסולוטית הישנה והחליפו אותה ב-1 מ"ל אתנול מוחלט טרי וסוניקט למשך 30 שניות.</li>
	<li>חזור על שלבים 1.11 ו- 1.12 לפחות ארבע פעמים.</li>
	<li>שמור את NWs ב 1 מ"ל של אתנול מוחלט בטמפרטורת החדר עד שהם נחוצים.</li>
	<li>למדוד את ריכוז הברזל ומכאן את NWs באמצעות ספקטרומטריית מסה פלזמה מצומדת אינדוקטיבית (ICP-MS). הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. עם זאת, עבור אחסון לאורך זמן, אל תשחרר את NWs מתבנית Al עד שיהיה צורך. שמירה על NW משוחרר מזרז אתנול במשך זמן רב ללא סוניקציה תכופה תיצור צברים כי יהיה צורך פעמים ארוכות יותר של סוניקציה כדי להיות מופרד.</li>
</ol>2. ציפוי הננו-חוטים ב-APTES
הערה: בפרוטוקול זה, 100 μL של תמיסת APTES (צפיפות של 0.946 גרם/מ"ל61) מספיקים כדי לצפות 1.6 x 107 מ'2/g של NWs. אם יש שינוי ביחס או במסה של הננו-חומר, יש להתאים את נפח APTES בהתאם.
<ol><li>העבר את NWs משלב 1.14 לצינור זכוכית 5 מ"ל באמצעות פיפטה 1 מ"ל.</li>
	<li>כדי לאסוף את כל NWs שנותרו בצינור 2 מ"ל, לשטוף את הצינור הריק 2 מ"ל פעמיים על ידי הוספת 1 מ"ל של אתנול מוחלט ולהעביר אותו לצינור זכוכית 5 מ"ל באמצעות פיפטה 1 מ"ל.</li>
	<li>באמצעות פיפטה, לקחת 100 μL של APTES ולהוסיף אותו לפתרון NW ישירות.</li>
	<li>מערבול את צינור הזכוכית 5 מ"ל במשך 10 שניות.</li>
	<li>כוונן את צינור הזכוכית 5 מ"ל על המהדק של מעמד תגובה במעבדה.</li>
	<li>מניחים מחצית מצינור הזכוכית 5 מ"ל בתוך המים של האמבטיה העל-קולית וסוניקטים למשך שעה אחת.</li>
	<li>הוציאו את צינור הזכוכית 5 מ"ל מהאמבטיה העל-קולית והוסיפו 400 מיקרוליטר מים דה-יוניים (DI) ואחריו 20 מיקרוליטר של 1 M NaOH (קטליזה בסיסית). זהירות: חשוב להוסיף תחילה את מי DI.</li>
	<li>כוונן את צינור הזכוכית 5 מ"ל, כפי שמוסבר בשלבים 2.5-2.6, וסוניקט למשך שעה נוספת.</li>
	<li>הוציאו את צינור הזכוכית 5 מ"ל מהאמבטיה הקולית.</li>
	<li>הניחו מגנט ליד צינור הזכוכית למשך 5 דקות כדי לאסוף את ה- NWs.</li>
	<li>החליפו את הסופרנאטנט ב-1 מ"ל אתנול מוחלט טרי וסוניקט למשך 10 שניות.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.10-2.11 ארבע פעמים.</li>
	<li>העבר את כל האתנול המרחף NW לצינור זכוכית חדש של 5 מ"ל באמצעות פיפטה של 1 מ"ל. הערה: ניתן לאחסן את NW מצופה APTES בשפופרת זכוכית עם אתנול עד שהם נחוצים. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.</li>
</ol>3. ביו-פונקציונליזציה של ננו-חוטים
<ol><li>הפעלת הנוגדנים הערה: כדי להשיג כ-3 x 104 חלקים של נוגדן/NW, יש להשתמש ב-30 מיקרוליטר של נוגדן (1 מ"ג/מ"ל) לכל 0.1 מ"ג ברזל.<ol><li>בצינור של 2 מ"ל, יש להמיס 0.4 מ"ג של 3-3-דימתיל-אמינופרופיל קרבודימיד (EDC) ו-1.1 מ"ג של סולפו-N-הידרוקסי-סולפוסוקסינימיד (Sulfo-NHS) ב-1 מ"ל של הידרט חומצה אתנסולפונית 2-N-מורפולינו (MES) (pH 4.7). הערה: תערובת EDC/sulfo-NHS צריכה להיות טרייה ומוכנה לפני השימוש.</li>
		<li>בצינור חדש של 2 מ"ל, הוסף 30 μL של נוגדן נגד CD44 (1 מ"ג / מ"ל), 960 μL של 0.1 M של מלח חוצץ פוספט (PBS, pH 7), ו 10 μL של תערובת EDC / sulfo-NHS (מוכן בשלב 3.1.1), בהתאמה.</li>
		<li>הניחו את הצינור בנפח 2 מ"ל בשייקר צינור בגודל 10 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת ננו-חוטים מצופים APTES<ol><li>במהלך הדגירה בת 15 הדקות בשלב 3.1.3, שטפו את ה-NWs על ידי הצבת מגנט ליד צינור ה-NWs המצופה APTES (משלב 2.13) למשך 2 דקות כדי לאסוף את ה-NWs.</li>
		<li>השליכו את האתנול והחליפו אותו ב-1 מ"ל של 0.1 מ"ל PBS (pH 7), ולאחר מכן בצעו סוניקציה למשך 10 שניות.</li>
		<li>חזור על שלב 3.2.1-3.2.2 ארבע פעמים.</li>
		<li>אסוף את ה- NWs, כפי שמוסבר בשלב 3.2.1, והשלך את PBS 0.1 M. שמור את NWs בצינור ללא כל פתרון.</li>
	</ol></li>
	<li>התקשרות הנוגדנים<ol><li>העבר את כל תמיסת הנוגדנים המופעלת (שהוכנה בשלב 3.1.3) לצינור NWs (מוכן ב- 3.2.4) וסוניקט למשך 10 שניות.</li>
		<li>הניחו את צינור הזכוכית במסובב למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.</li>
		<li>אספו את ה-NWs באמצעות מגנט כמו בשלב 3.2.1 והשליכו את הסופר-נטנט.</li>
		<li>הוספת 1 מ"ל של תמיסת אלבומין בסרום בקר 2% (BSA) למשך שעה אחת ב-4°C כדי לחסום את התגובה.</li>
		<li>בדוק את האנטיגניות של NW פונקציונלי נוגדנים, למשל, באמצעות immunoprecipitation (IP) ו כתם מערבי (WB) assays. הערה: לקבלת תוצאות טובות יותר, השתמש ב- NW הפונקציונלי ביולוגית בבדיקת IP, WB או תאימות ביולוגית מיד לאחר שלב החסימה.</li>
	</ol></li>
</ol>4. בדיקת תאימות ביולוגית
הערה: כדי לחקור את התאימות הביולוגית של NWs, ניתן להשתמש במבחני כדאיות תאים שונים ובקווי תאים שונים. ריכוז ה-NWs המשמשים כאן מבוסס על פרסום קודם16. זריעת התאים צריכה להיעשות יום אחד לפני התפקוד הביולוגי של NW.
זהירות: כל השלבים הבאים צריכים להיעשות תחת ארון הבטיחות הביולוגית.
<ol><li>בצלחת של 96 בארות, זרעו תשע בארות עם 4 x 104 של תאי סרטן המעי הגס (קו תאי HCT116) מרחפים במדיה של תרבית תאים של McCoy (100 μL / באר) ומניחים אותו בתוך האינקובטור למשך הלילה ב 37 ° C ו 5% פחמן דו חמצני (CO2).</li>
	<li>שטפו את ה-NWs (משלב 3.3.4) עם PBS על ידי איסופם באמצעות מגנט כמו בשלב 3.2.1 והחלף את התמיסה הישנה ב-1 מ"ל של 0.01 M PBS (pH 7). חזור על שלב זה שלוש פעמים.</li>
	<li>שטפו את ה-NWs (משלב 4.2) עם המדיה המחוממת של McCoy על ידי איסופם באמצעות מגנט כמו בשלב 3.2.1 והחליפו את PBS הישן ב-1 מ"ל של מדיה מחוממת של McCoy. חזור על שלב זה שלוש פעמים.</li>
	<li>איסוף NWs (משלב 4.3) באמצעות מגנט כמו בשלב 3.2.1 ולהחליף את 1 מ"ל של מדיה מחוממת McCoy עם 900 μL של מדיה מחוממת McCoy. ריכוז NWs צריך להיות 0.02 מ"ג של NWs לכל מ"ל.</li>
	<li>קח את צלחת 96 בארות (משלב 4.1) מן האינקובטור אל ארון הבטיחות הביולוגית.</li>
	<li>מתחת לארון הבטיחות הביולוגית, השליכו את המדיה הישנה מהתאים והחליפו אותה ב-100 מיקרוליטר של NW מרחף (שהוכן בשלב 4.4).</li>
	<li>נערו את הצלחת (שהוכנה בשלב 4.6) ביד ולאחר מכן דגרו עליה במשך 24 שעות בתוך האינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.</li>
	<li>למחרת, הוציאו את צלחת 96 הקידוחים (שהוכנה בשלב 4.7) מהאינקובטור. תחת ארון הבטיחות הביולוגית, הוסף 11 μL של מגיב כדאיות התא (טבלה של חומרים) לכל באר באמצעות פיפטה מרובת דפנות.</li>
	<li>נערו את הצלחת עם שייקר הצלחת במהירות של 10 x גרם במשך 10 שניות.</li>
	<li>דוגרים על הצלחת במשך שעה באינקובטור.</li>
	<li>הוציאו את צלחת 96 הקידוחים (שהוכנה בשלב 4.10) מהאינקובטור. קרא את הלוח בקורא המיקרו-צלחות (רשימת חומרים) על-ידי מדידת הספיגה של מגיב הכדאיות של התא (עירור 540 ננומטר, פליטה 590 ננומטר).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כמו בכל שיטת ייצור וציפוי ננו-חומרים, נדרשת איכות גבוהה של הפתרונות המשמשים. ניתן לעשות שימוש חוזר בפתרונות השחרור (1 M NaOH) והפונקציונליות (MES) מספר פעמים. עם זאת, בדיקת ערך ה- pH שלהם לפני תחילת תהליך חדש חשובה מאוד. בשלב השחרור, שטיפת NWs עם NaOH צריך להתבצע לפחות ארבע פעמים. ככל שהכביסה טובה יותר, כך יציבות ה-NW טובה יותר ופחות הם מצטברים. שכבת התחמוצת משפרת את יציבות ה-NWs בעת טבילה באתנול או במים63.
הקוטר והאורך של ה-NW הושפעו לאחר שציפויים אותם ב-APTES ובנוגדנים. כאן, הקוטר גדל מ 41.5 ננומטר ל 70 ננומטר, ואת האורך ירד מ 2.5 מיקרומטר ל 1.6 מיקרומטר, בשל שלבי סוניקציה לשבור NWs. לכן, חיוני לאפיין את המורפולוגיה של NWs לאחר שלב biofunctionalization.
החיבור של הנוגדנים ל- NWs מסתמך על האינטראקציה הקוולנטית בין קבוצת האמין (על APTES) לבין קבוצת הקרבוקסיל (על הנוגדן). לכן, אישור נוכחותו של ציפוי APTES הוא צעד חשוב, שעבורו השתמשנו במיפוי EELS. שיטת הציפוי בטוחה ופשוטה. זה לא צריך טמפרטורות גבוהות או זמני דגירה ארוכים. כמו כן, ציפוי APTES פועל כמקשר כדי לאפשר התקשרות קוולנטית של נוגדנים או חלבונים אחרים שיש להם קבוצת קרבוקסיל.
במקרה של תפקוד ביולוגי של NWs עם נוגדן, האנטיגניות של אתרי הקישור של הנוגדנים לאחר תהליך biofunctionalization יכול להיות מושפע. ניתן להשתמש בשיטת IP ו- WB כדי לחקור בעיה זו. שימוש בשיטת הביו-פונקציונליזציה המוזכרת בפרוטוקול זה יאפשר לנוגדנים להיקשר ל-NWs עם אנטיגניות גבוהה לקולטן תא מסוים. יתר על כן, תפקוד ביולוגי של NWs עם נוגדנים הוסיף את היכולת לכוון את התאים עם קולטן של עניין, CD44 כאן. זה אושר על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי. למרות שהתאימות הביולוגית של NWs לא מצופים הייתה גבוהה (>95%), הוספת ציפוי APTES או נוגדנים ל- NWs שיפרה את התאימות הביולוגית שלהם ב- 100%.
יתר על כן, פרוטוקול הציפוי והביו-פונקציונליזציה יעיל, חסכוני וניתן לשחזור. זה צריך להיות ישים לכל ננו-חומר תחמוצת ברזל אחר, שבו ריכוז הציפוי והנוגדנים המחוברים צריך להיות אופטימלי בהתבסס על שטח הפנים והמסה של הננו-חומר. פרוטוקול זה יכול להיעשות בבטחה בתנאי הסביבה במעבדה הכללית. הביו-פונקציונליזציה שיפרה באופן משמעותי את התאימות הביולוגית של הננו-חומר ואת יכולת המיקוד שלו. באופן כללי, NWs הם חומרים מבטיחים ביותר עבור יישומים ננו-רפואיים (כולל טיפולים רב-מודאליים או קומבינטוריים, זיהוי או הנחיה של תאים, וחישה ביולוגית). בשילוב עם ביו-פונקציונליזציה, כפי שמתואר כאן, ניתן להשיג מיקוד תאים ספציפי לשיפור הדיוק והיעילות.

תכונה ייחודית של ננו-חומרים מגנטיים היא יכולתם להגיב לשדות מגנטיים1, אשר ניתן לנצל לתועלת כדי להפעיל אותם בדרכים רבות , בעוד שהם יכולים גם להיות מנוטר, למשל, על ידי דימות תהודה מגנטית (MRI). בעת החלת שדה מגנטי לסירוגין בתדר גבוה, הם יכולים ליצור חום, אשר יכול לגרום היפרתרמיה, מתן אפשרות טיפולית1. גישה נוספת היא טיפול פוטותרמי, אותו ניתן לממש באמצעות לייזר אינפרא אדום קרוב (NIR) 2,3.
בין המספר הגדול של ננו-חומרים מגנטיים, תחמוצת ברזל קיבלה את תשומת הלב הגדולה ביותר ביישומים ביולוגיים כגון הפרדה מגנטית, היפרתרמיה2,4, הנחיית תאים5, אספקת תרופות 6,7,8, וכחומר ניגוד ב- MRI 9,10. זאת בשל תאימות ביולוגית גבוהה שלהם 11,12, מגנטיזציה גדולה 11,12, יכולת להיות מצופה 9,13,14,15, יכולת לשאת תרופות 2,16, יכולת לתפקד עם תרופות2,16 או/ו סוכני מיקוד12,13,17,18, ויכולת להמיר אנרגיה אופטית לחום2. לאחרונה, MagForce החלה בניסויים קליניים בחולי סרטן המשתמשים בננו-חלקיקי תחמוצת ברזל לטיפול בהיפרתרמיה19.
לאחרונה, ננו-חוטים מגנטיים (NWs) מנוצלים יותר ויותר ליישומים ביו-רפואיים 3,11,16,20,21,22. יש להם תכונות דומות לננו-חרוזים מגנטיים, אך הם מציעים צורה אנאיזוטרופית ומומנט מגנטי גדול מאוד, המאפשר שליטה מרחוק יעילה מאוד על ידי שדה מגנטי23,24, כולל הפעלה בתדר נמוך כדי לגרום לאפקטים מגנטו-מכניים 25,26,27,28,29. כתוצאה מכך, NWs יושמו עבור יישומים ביולוגיים שונים כגון בידוד אקסוזומים30 מעקב אחר תאים 21, טיפול בסרטן 3,11,16, אספקת תרופות 16,31,32, וכחומר ניגוד MRI 33.
ננו-חומרים מגנטיים ביו-פונקציונליים בעלי יכולת מיקוד תאים ספציפית הם בעלי פוטנציאל גדול ליישומים ביו-רפואיים וברפואה מדויקת34,35. כדי לחבר את סוכני המיקוד הללו, נדרש שינוי פני השטח של הננו-חומרים. בדרך כלל, הם זקוקים לציפוי המספק קבוצה פונקציונלית, המאפשרת את החיבור של הסוכנים המטפלים. בספרות, יש מספר רב של ציפויים אורגניים ואי-אורגניים עבור ננו-חומרים מגנטיים. בהתבסס על הקבוצה הפונקציונלית שניתן לשתק לננו-חומר, ניתן לסווג ציפויים אלה לארבע קבוצות עיקריות: מולקולות המבוססות על קבוצות חומצה קרבוקסילית, פולימרים, היסטידין ומולקולות המבוססות על קבוצות סילאן.
המולקולות המבוססות על קבוצות חומצה קרבוקסילית היא אחת משיטות שינוי פני השטח. הוא מנצל את האהדה הגבוהה בין קבוצת החומצה הקרבוקסילית השלילית על הציפוי לבין המטען החיובי על הננו-חומרים המגנטיים36,37,38. תהליך הקשירה של חומצה קרבוקסילית למשטח מתכת עשוי לכלול יצירה של מלחי מתכת-קרבוקסילט או היצמדות של קבוצת הקרבוקסיל למתכת. עם זאת, עבור NW רב-מקטעים, כגון ברזל/זהב או ניקל/זהב NWs, שיש להם תכונות מעולות עבור יישומים ביולוגיים39,40, סוג זה של ציפוי לא יכול להיות מיושם בקלות. הוא דורש שני ציפויים שונים בו זמנית: קבוצות תיול לשינוי מקטעי הזהב וקבוצות קרבוקסיל למקטעים מגנטיים (ברזל או ניקל)38. כמה דוגמאות למולקולות המבוססות על קבוצות קרבוקסיל הן המטופורפירין, חומצה פימלית, חומצה פלמיטית, וחומצה פרופיונית 3-[(2-אמינואתיל) דיתיו] (AEDP)38. שינויים בפני השטח של ננו-חומרים מגנטיים באמצעות פולימרים מציעים כמה יתרונות ברורים. בשל המשקל המולקולרי הגדול של הפולימרים, הוא משפר את יציבות הננו-חומר המגנטי בתמיסה38. עם זאת, זה יגדיל באופן משמעותי את גודל ננו-חומר38. פוליוויניל פירולידון (PVP), פוליאתילנימין (PEI), חומצה אספרטית ארגינין-גליצין-D (RGD) ופוליאתילן גליקול (PEG) הם כמה דוגמאות לפולימרים הנפוצים ביותר לשינויים בפני שטח. לכל אחד מהם תכונות משלו ומשתמשב-38. שיטת שינוי פני השטח השלישית היא באמצעות ציפוי היסטידין. היסטידין הוא חלבון בעל שרשרת צדדית של חומצות אמינו היסטידין בעל זיקה גבוהה למספר מוגבל של ננו-חומרים מגנטיים כגון ניקל38. ניתן להשתמש בו לתהליכי טיהור חלבונים 38,41,42. ציפוי היסטידין יכול להיות מיושם גם על NW רב-מקטעים, כגון ניקל/זהב NWs38. סילניזציה של משטח ננו-חומר היא תהליך מבוסס היטב 38,43,44. הוא מבוסס על אטום סיליקון המקושר לכל משטח תחמוצת מתכת באמצעות שלושה קשרים בודדים, ובמקביל אטום סיליקון זה נקשר לקבוצה הפונקציונלית בסוף דרך שרשרת אלקיל 38,43,44. היתרון של ציפוי זה הוא מתן קבוצות אמין חופשיות, ויש לו את היכולת לצפות חומרים מגנטיים ולא מגנטיים38,45, כגון ניקל וזהב, בהתאמה. לכן, שימוש במולקולות המבוססות על קבוצת המלח הוא מסלול מעשי לביו-פונקציונליזציה של NW רב-מקטעים. דוגמאות למולקולות המבוססות על קבוצות סילאן הן (3-aminopropyl), triethoxysilane (APTES) ו-(3-aminopropyl) trimethoxysilane (APTMS)38,45.
הוספת חומר מיקוד לציפוי יכולה למלא תפקיד משמעותי הן באבחון והן בטיפול בתאים חולים, ובמקביל למזער את תופעות הלוואי על רקמות בריאות46,47. הוספת חומר מיקוד על פני השטח של ננו-חומרים משפרת הן את הקישור הסלקטיבי התאי והן את ההפנמה באמצעות קולטני אנדוציטוזה7. ללא ליגנדות מטרה אלה, ננו-חומרים מתקשרים באופן לא ספציפי עם קרום התא, אשר נקשר בקצב נמוך יותר בהשוואה לננו-חומרים עם ליגנדות48. אחד האתגרים במיקוד רקמות סרטניות הוא הדמיון האופייני שלהן לרקמות בריאות. לכן, הצלחת המיקוד תלויה בעיקר בקביעת הליגנד המתאים לשימוש כמטרה ביולוגית49,50. סוכני מיקוד שונים שימשו כדי לכוון ננו-חומרים לתאי סרטן48,51 (למשל, CD44, בשל הביטוי הגבוה שלו בתאי סרטן בהשוואה לתאים בריאים52,53,54,55).
ניתן לסווג את סוכני המיקוד לשלוש קבוצות עיקריות, בהתבסס על המרכיבים מהם הם עשויים ומורכבותם: מיקוד מבוסס אפטמר, מיקוד מבוסס ליגנד ומיקוד מבוסס נוגדנים. Aptamers הם גדילים קצרים מסונתזים כימית של DNA או RNA-oligonucleotides המקופלים למבנים דו ותלת ממדיים, מה שהופך אותם מסוגלים להתמקד אנטיגן מסוים, לרוב חלבונים56. מיקוד מבוסס ליגנד כולל פפטידים ושרשראות חומצות אמינו קצרות57. מיקוד מבוסס נוגדנים כרוך בשימוש בנוגדן שלם, או במקטעי נוגדנים, כגון מקטעים משתנים בעלי שרשרת אחת או מקטעים קושרי אנטיגן51. לשימוש בשיטה זו יש יתרון בכך שיש לו שני אתרי קשירה בעלי זיקה גבוהה לאנטיגן המטרה הספציפי שלו, מה שמקנה לו סלקטיביות גבוהה ביותר58. אתרי הקשירה מקבילים למנעול והאנטיגן למפתח58.
בעבודה זו, NWs בשימוש יוצרו על ידי אלקטרודפוזיציה על ממברנות תחמוצת אלומיניום, שיטה שתוארה בפירוט בפרסום קודם59. ההתמקדות כאן היא בשחרור NW אלה של תחמוצת ברזל-ברזל (קליפת הליבה) מהממברנות ותפקודם הביולוגי עם נוגדנים ספציפיים כדי לספק יכולת מיקוד. הנוגדנים אינם יכולים להיקשר ישירות לתחמוצת הברזל-ברזל NWs ודורשים מקשר. ציפוי ה-NWs ב-APTES מספק קבוצות אמין חופשיות, מה שמאפשר את ההתקשרות הקוולנטית דרך קבוצת הקרבוקסיל על הנוגדנים (איור 1). היתרון של ציפוי APTES הוא היכולת שלו לעבוד הן עבור חומרים מגנטיים21 והן עבור חומרים לא מגנטיים60 , כגון ברזל/זהב או ניקל/זהב NWs45. ניתן להשתמש בכל שלבי הציפוי והביו-פונקציונליזציה המוסברים בפרוטוקול זה עם כל ננו-חומר של תחמוצת ברזל/ברזל, באופן כללי. NW של תחמוצת ברזל / ברזל שימשו כאן כדוגמה. התוצאות מראות כי NWs פונקציונלי נוגדנים יש אנטיגניות גבוהה קולטנים פני התא ספציפיים, אשר יכול לשמש עבור יישומים שונים. דוגמאות כוללות הפרדת תאים, אספקת תרופות, טיפול ספציפי בתאים סרטניים באמצעות טיפולים פוטותרמיים ו / או מגנטו-מכניים.

<table><tbody><tr><td>2 mL tube (snap-cap Microcentrifuge)</td><td>Eppendorf, Fisherscientific</td><td>05-402-7</td><td></td></tr><tr><td>2-N-Morpholino EthaneSulfonic acid hydrate 99% (MES)</td><td>Thermscientific</td><td>AC172590250</td><td>Concentration 0.1 M and pH 4.7</td></tr><tr><td>3-3-Dimethyl-aminopropyl Carbodiimide (EDC)</td><td>Thermofisher</td><td>PG82079</td><td></td></tr><tr><td>3-AminoPropyl-Tri-Ethoxy-Silane (APTES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>919302</td><td></td></tr><tr><td>5 mL glass tube</td><td>Fisherscientific</td><td>03-339-22C</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate ( flat bottom)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3595</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD44 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>550990</td><td>Clone 515, concentration 1 mg/mL</td></tr><tr><td>APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilane), 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>919-30-2</td><td>Concentration 99%</td></tr><tr><td>BCA assay (Pierce BCA Protein Assay Kit)</td><td>Thermofisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin solution (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Concentration 35%</td></tr><tr><td>Cell incubator</td><td>Thermofisher</td><td>50116047</td><td></td></tr><tr><td>Cell viability reagent</td><td>AlamarBlue,Thermofisher</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>Colon cancer cells - HCT116 cell line</td><td>ATCC</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Hardwood Hammer</td><td></td><td></td><td>Any hammer tool can be used, there is no specific brand.</td></tr><tr><td>Inductively coupled plasma Mass Spectrometer (ICP-MS)</td><td>Perkin Elmer</td><td>ELAN 9000 ICP-MS</td><td>The used software is &quot;Elan instrument control session&quot;</td></tr><tr><td>Laboratory Retort Stand with Clamp</td><td>RVFM</td><td>13-0140</td><td>This is used to handle the 5 mL glass tube in the sonicator bath.</td></tr><tr><td>Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet)</td><td>Thermofisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>McCoy&amp;rsquo;s 5A Medium 1x</td><td>Gibco</td><td>16600082</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader (Bio-Rad xMark Absorbance Spectrophotometer)</td><td>Bio-Rad</td><td>1681150</td><td>Microplate Manager 6 software (#168-9520)</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS) 10x</td><td>Gibco</td><td>14200067</td><td>Concentration 0.1 M (No calcuim, no magnesium)</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS) 1x</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td>Concentration 0.01 M (No calcuim, no magnesium)</td></tr><tr><td>Plate shaker (Microplate Genie)</td><td>Scientific Industries (Genie)</td><td>SI-0400</td><td></td></tr><tr><td>Single Edge Razor blades</td><td>Polysciences</td><td>08410-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodum hydrixide (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2</td><td>Concentration 1 M, pH 13</td></tr><tr><td>Sulfo-N-HydroxySulfosuccinimide (sulfo-NHS)</td><td>Thermofisher</td><td>106627-54-7</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>ATCC</td><td>30-2101</td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Tube shaker (Eppendorf Thermomixer R Mixer, 2.0 mL)</td><td>Eppendorf, Fisherscientific</td><td>05-400-204</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic bath (2510)</td><td>Branson</td><td>2489502</td><td></td></tr></tbody></table>

biofunctionalization of magnetic nanomaterials

ננו-חומרים מגנטיים זכו לתשומת לב רבה ביישומים ביו-רפואיים שונים. ביו-פונקציונליזציה של ננו-חומרים אלה עם סוכני מיקוד ספציפיים היא היבט חיוני לשיפור יעילותם באבחון ובטיפולים תוך מזעור תופעות הלוואי. היתרון של ננו-חומרים מגנטיים בהשוואה לננו-חומרים שאינם מגנטיים הוא יכולתם להגיב לשדות מגנטיים ללא מגע ולמרחקים גדולים. זה מאפשר להנחות או לצבור אותם, בעוד שהם יכולים גם להיות פיקוח. לאחרונה, ננו-חוטים מגנטיים (NWs) עם תכונות ייחודיות פותחו עבור יישומים ביו-רפואיים. המומנט המגנטי הגדול של NW אלה מאפשר שליטה יעילה יותר מרחוק על תנועתם על ידי שדה מגנטי. זה נוצל בהצלחה רבה בטיפול בסרטן, אספקת תרופות, מעקב אחר תאים, התמיינות תאי גזע או הדמיית תהודה מגנטית. בנוסף, ייצור NW על ידי תצהיר אלקטרוכימי בסיוע תבנית מספק שיטה רב-תכליתית עם שליטה הדוקה על תכונות NW. במיוחד NW ברזל תחמוצת ברזל (מעטפת הליבה) NW מתאימים ליישומים ביו-רפואיים, בשל המגנטיזציה הגבוהה שלהם רעילות נמוכה.
בעבודה זו, אנו מספקים שיטה לתפקוד ביולוגי של NW של תחמוצת ברזל/ברזל עם נוגדנים ספציפיים המכוונים כנגד סמן פני תא ספציפי המתבטא יתר על המידה במספר רב של תאים סרטניים. מכיוון שהשיטה מנצלת את התכונות של משטח תחמוצת הברזל, היא ישימה גם לננו-חלקיקי תחמוצת ברזל על-פאראמגנטיים. ה- NWs מצופים תחילה ב- 3-aminopropyl-tri-ethoxy-silane (APTES) הפועל כמקשר, אליו הנוגדנים מחוברים באופן קוולנטי. ציפוי APTES והביו-פונקציונליזציה של הנוגדנים מוכחים על ידי ספקטרוסקופיית אובדן אנרגיה אלקטרונים (EELS) ומדידות פוטנציאליות zeta. בנוסף, האנטיגניות של הנוגדנים על NWs נבדקת באמצעות immunoprecipitation ו כתם מערבי. המיקוד הספציפי של NWs ביו-פונקציונליים והתאימות הביולוגית שלהם נחקרים על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי ובדיקת כדאיות התא.

חשוב לחתוך את דיסקיות האלומיניום (Al) (איור 2A) לחתיכות קטנות (איור 2B) כדי שיתאימו לצינור שבו משתמשים. לאחר הוספת 1 M NaOH לחתיכות אל, תגובה צריכה להתחיל מיד, אשר נצפתה על ידי יצירת בועות. אם לא מתרחשת תגובה תוך דקה אחת או אם התגובה מהירה מאוד והתמיסה הופכת עכורה לחלוטין עם ענן לבן, הסר מיד את תמיסת NaOH הישנה והחלף אותה בתמיסה חדשה. בדוק את ערך ה- pH של תמיסת NaOH. זה צריך להיות pH>12. כאשר ה-NWs משתחררים מחתיכות ה-Al ב-30 הדקות הראשונות עם NaOH, ה-NWs (אשכולות שחורים, איור 3A) יצופו בתוך תמיסת NaOH. בשלב האחרון של שחרור NWs, הפתרון צריך להיות הומוגני. שום אשכול של NWs לא צריך להיות שם (איור 3B). אם NW נאספו עם מגנט במשך 3 דקות, התמיסה צריכה להיות ברורה, וגלולת NW צריכה להיות שחורה (איור 3C). אם הגלולה הייתה אפורה, השליכו את הצינורית והתחילו שוב עם דגימת Al חדשה.
במהלך תהליך השחרור, NWs מקבלים שכבת תחמוצת ברזל טבעית עם עובי סביב 5 ננומטר, אשר דומה לדיווחים קודמים11,16,20. לשכבת תחמוצת זו תרומה חשובה לתאימות ביולוגית 16, פונקציונליות16,18 ותכונות מגנטיות20 של NWs. עם זאת, שמירה על NWs בתבנית שלהם (כלומר, לא לשחרר אותם) עד הצורך תמנע מהם השפעות סביבתיות עליהם. הקוטר והאורך הממוצעים של ה-NW לאחר תהליך השחרור היו 2.5 מיקרומטר ו-41.5 ננומטר, בהתאמה. ניתן לחשב את המסה של NW יחיד כפי שמוסבר בטבלה 1 והיא אושרה על ידי ספקטרוסקופיית מסה פלזמה מצומדת אינדוקטיבית (ICP-MS). כאן, כל דיסק אלומינה הכיל סביב 0.3 מ"ג ברזל.
כדי להפחית את הצבירה של NWs לאחר שחרורם ולאפשר פונקציונליות נוספת, NWs צופו ב-APTES. ציפוי זה מספק קבוצות אמין חופשיות ויש לו את היכולת לצפות חומרים מגנטיים ולא מגנטיים39,45, מה שהופך אותו מתאים לציפוי NW רב מקטעים כגון NW ברזל / זהב. במהלך ציפוי ננו-חוטים, חשוב להתמקד בשני דברים. ראשית, חשב את הנפח הדרוש ממולקולות APTES62 בהתבסס על שטח הפנים והמסה של NWs. חישובים אלה הוצגו בלוח 2. שנית, שמור על ננו-חוטים בתנועה רציפה כדי למנוע הצטברות שלהם וחסימה של חלקים מסוימים של משטחי NW מציפוי APTES. לדוגמה, בפרוטוקול זה, הננו-חוטים הודגרו תחת האמבטיה העל-קולית והמסובב במהלך ציפוי APTES ותפקוד הנוגדנים, בהתאמה. כל מולקולת APTES מכילה אטום סיליקון וקבוצת אמין פונקציונלית טרמינלית21. לכן, ניתן להשתמש במפות ספקטרוסקופיית אובדן אנרגיה אלקטרונים (EELS) כדי לאשר את נוכחותו של ציפוי APTES על-ידי הצגת אטומי סיליקון (צבע ורוד) על פני השטח של NW (איור 4A). לעומת זאת, אטומי NW שאינם מצופים מראים אטומי ברזל בכחול קליפה (איור 4B) ואטומי תערובת ברזל/חמצן בכחול בהיר (איור 4B). מיפוי EELS המתאים של NW לא מצופה (איור 4C,4D) מראה עוצמה גבוהה יותר של ברזל לעומת חמצן במרכז (איור 4C) מאשר על פני השטח (איור 4D), מה שמצביע על מבנה תחמוצת ברזל (מעטפת הליבה). מיפוי EELS (איור 4 C,4D) זוהה כי שכבת תחמוצת הברזל על NWs היא Fe 3 O4 יותר מאשר Fe2O3, בדומה לפרסום קודם20.
ניתן לאשר את האנטיגניות של הנוגדנים המצורפים באמצעות מבחני IP ו-WB, שבהם ניתן לצפות בפס על הדגימה החיובית אך לא על קבוצת הבקרה השלילית (איור 5). שימו לב שכדי לשמור על פס ברור, אין להשתמש בפחות מ-0.1 מ"ג NWs/10 x 106 תאים. בדיקת BCA (טבלה של חומרים) בשילוב עם כמה חישובים המוצגים בטבלה 3 שימשה לכימות מספר הנוגדנים על NW.
יתר על כן, מדידת פוטנציאל הזטה שימשה להבהרת פונקציונליות פני השטח. קבוצת האמינים הסופיים ב-APTES הפחיתה את המטען השלילי של NW ללא ציפוי, כפי שניתן לראות באיור 6. NWs המתפקדים על-ידי נוגדנים גם שינו את המטען בהשוואה ל-NW מצופה APTES (איור 6). כל מדידות פוטנציאל הזטה נעשו ב-pH 7.
ניתן לאשר את מיקוד התאים הספציפיים של NWs המתפקדים על-ידי נוגדנים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 7). יש לבדוק את התאימות הביולוגית של כל ננו-חומר חדש לפני תחילת כל יישום. לכן, נעשה שימוש בבדיקת כדאיות התא, והיא אישרה שה-NW הלא-מצופה, המצופה APTES והנוגדנים היו תואמים ביולוגית אפילו עם ריכוז גבוה (איור 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig01.jpg"> איור 1: סכמטי מייצג את שיטת הציפוי והביו-פונקציונליזציה של ננו-חוטים. (A) ציפוי ברזל NW עם APTES. (B) הפעלת הנוגדנים באמצעות EDC + Sulfo-NHS, כדי שיהיה בסוף (C) ננו-חוט פונקציונלי של נוגדן. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61360/61360fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig02.jpg"> איור 2: דיסק אלומיניום שהושקע בברזל. (א) דיסק האלומיניום לפני החיתוך. (B) הקווים האדומים הראו היכן לחתוך את הדיסק. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61360/61360fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig03.jpg"> איור 3: שלבי שחרור ננו-חוטים. (A) אשכולות של ננו-חוטים צפים בתמיסת NaOH. התמונה צולמה 10 דקות לאחר הוספת NaOH ולאחר הסרת קרום Al . (B) ננו-חוטים המרחפים באתנול. התמונה צולמה בשלב השחרור האחרון, מיד לאחר שלב הסוניקציה. (C) גלולת ננו-חוט שחורה שנאספה על ידי מגנט. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61360/61360fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig04.jpg"> איור 4: מפת ספקטרוסקופיית אובדן אנרגיה של אלקטרונים (EELS). (A) ננו-חוט מצופה APTES (APTES-NW). הצבעים הכחול והוורוד מייצגים אטומי ברזל וסיליקון, בהתאמה. (B) ננו-חוט לא מצופה (NW). צבעי הכחול והתכלת מייצגים את מיפוי תערובת הברזל והברזל/חמצן, בהתאמה. מיפוי EELS המתאים של (C) הליבה ו-(D) המעטפת של NW שאינם מצופים. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61360/61360fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig05.jpg"> איור 5: אישור תפקוד ופעילות של ננו-חוטים מצומדים של נוגדנים. האנטיגניות של CD44-NWs אושרה באמצעות משקעים חיסוניים (IP) וכתם מערבי (WB). +Ve: מייצג את הבקרה החיובית (ליזט תא מלא). -Ve: מייצג את הבקרה השלילית (רק NW לא מצופה). - תאי CD44: מייצג תאים שאינם מבטאים אנטיגן CD44; + תאי CD44: מייצג תאי סרטן המעי הגס המבטאים אנטיגן CD44. זהו כתם מייצג של n = 3 ניסויים עצמאיים. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61360/61360fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig06.jpg"> איור 6: ערכים פוטנציאליים של Zeta עבור NWs, APTES-NW ונוגדנים. העמודות מייצגות את הממוצע ± שגיאת תקן. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61360/61360fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig07.jpg"> איור 7: תמונות מיקרוסקופיות קונפוקליות מראות את המיקוד הספציפי. CD44-NWs מוצגים מתחברים (A ו- C), בעוד שה- Isotype-NWs (בקרה שלילית) לא התחברו (B ו - D). הצבעים אדום, כחול וירוק מייצגים את קרום התא, הגרעין וצביר CD44-NWs, בהתאמה. A ו- B הן תמונות השדה הבהירות של C ו- D, בהתאמה. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61360/61360fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig08.jpg"> איור 8: מחקר כדאיות התא של תאי סרטן המעי הגס (HCT116) מודגרים עם פורמולציות שונות של ננו-חוטים. התאים טופלו ב-NWs לאחר 24 שעות של דגירה ולאחר מכן הודגרו במשך 24 שעות עם NWs. כל הניסויים בוצעו בתוך אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. העמודות מייצגות את הממוצע ± שגיאת תקן. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61360/61360fig08large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>פרמטר</td>
			<td>ערך</td>
			<td>יחידה</td>
			<td rowspan="6"></td>
			<td rowspan="6"></td>
		</tr><tr><td>אורך Fe NW (h)</td>
			<td>2.6</td>
			<td>מיקרומטר</td>
		</tr><tr><td>רדיוס (קוטר/2) (r)</td>
			<td>0.01679231</td>
			<td>מיקרומטר</td>
		</tr><tr><td>צפיפות Fe (D)</td>
			<td>7.87</td>
			<td>גר'/ס"מ3</td>
		</tr><tr><td>1 נפח Fe NW (V) = π r^2h</td>
			<td>2.30E-15</td>
			<td>ס"מ 3</td>
		</tr><tr><td>1 Fe NW מסה = V x D</td>
			<td>1.80E-08</td>
			<td>מיקרוגרם</td>
		</tr><tr><td>1 שטח פנים Fe NW = 2π r^2 + 2πrh</td>
			<td>2.76E-01</td>
			<td>מיקרומטר2</td>
			<td>2.8E+05</td>
			<td>נ.מ.מ 2</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: חישוב מסת הברזל NW.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>פרמטר</td>
			<td>ערך</td>
			<td>יחידה</td>
		</tr><tr><td>צפיפות APTES/100 μL*</td>
			<td>9.50E-01</td>
			<td>g</td>
		</tr><tr><td>מולקולר ווייט (MW) של APTES</td>
			<td>2.21E+02</td>
			<td>גר'/מול</td>
		</tr><tr><td>מספר שומה APTES = מסה / MW</td>
			<td>4.29ה-03</td>
			<td>מול</td>
		</tr><tr><td>מספר מולקולות APTES/100 μL**</td>
			<td>2.57E+21</td>
			<td>מולקולות</td>
		</tr><tr><td>גודל APTES ***</td>
			<td>5.00E-01</td>
			<td>ננומטר</td>
		</tr><tr><td>שטח הפנים של APTES</td>
			<td>2.00E-01</td>
			<td>נ.מ.מ 2</td>
		</tr><tr><td>שטח פנים NW ****</td>
			<td>2.76E+05</td>
			<td>נ.מ.מ 2</td>
		</tr><tr><td>מספר NWs ב 0.3mg של NW ****</td>
			<td>1.70E+10</td>
			<td>NWs</td>
		</tr><tr><td>מספר מולקולות APTES הדרושות ליצירת שכבה אחת סביב NW</td>
			<td>1.38E+06</td>
			<td>מולקולת APTES</td>
		</tr><tr><td>מספר מולקולות APTES הדרושות עבור 0.3 מ"ג של NWs</td>
			<td>2.35E+16</td>
			<td>מולקולת APTES</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*שבירה מספר 61</td>
		</tr><tr><td colspan="3">** מספר מולקולות = מספר מול*אבוגדרו (6E+23)</td>
		</tr><tr><td colspan="3">שבירה מספר 62</td>
		</tr><tr><td colspan="3">מטבלה 1</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: חישוב מספר מולקולות APTES הדרושות לציפוי NWs.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> </td>
			<td>נוגדן IgG בצורת Y</td>
			<td>NW</td>
		</tr><tr><td>מסה לנוגדן אחד</td>
			<td>2.3E-13 מיקרוגרם</td>
			<td>1.8E-08 מיקרוגרם*</td>
		</tr><tr><td>שטח פנים לנוגדן אחד</td>
			<td>23 נאנומטר2</td>
			<td>2.6E+05 נאנומטר2</td>
		</tr><tr><td>מבוסס על בדיקת BCA</td>
			<td colspan="2">0.3 מ"ג ל-1 מ"ג</td>
		</tr><tr><td>מספר מולקולת הנוגדן ו- NW ב- 0.3 מ"ג נוגדנים למ"ג NW</td>
			<td colspan="2">~1E + 15 נוגדנים ** לכל ~ 5.6E + 10 NW</td>
		</tr><tr><td>מספר מולקולת נוגדנים לכל NW</td>
			<td colspan="2">~2E+04 נוגדנים לכל 1 NW***</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*מחושב מטבלה 1</td>
		</tr><tr><td colspan="3">**מספר הנוגדנים ב-0.3 מ"ג חושב על ידי חלוקת מספר הנוגדנים שקיבלנו מבדיקת BSA (0.3 מ"ג) במשקל המולקולרי הממוצע של נוגדני IgG בצורת Y (180 kDa = 3E-16 מ"ג).</td>
		</tr><tr><td colspan="3">בהתבסס על שטח הפנים של מולקולה אחת של נוגדני IgG בצורת Y (~23 nm2) ושטח הפנים של NW אחד (~2.6E+05 nm2), סביב 1E+04 נוגדנים יספיקו כדי ליצור שכבה אחת על NW. במקרה שלנו, צפיפות הנוגדנים הייתה גבוהה פי שניים מהכמות הצפויה. זה יכול להיות קשור לציפוי APTES המספק יותר זרועות המאפשר חיבור גבוה של הנוגדנים. מקרה זה מבטיח כי NW מכוסה במלואו עם נוגדנים ואת ההזדמנות עבור הנוגדן להיקשר אנטיגן פני התא, ללא קשר לכיוון של NWs יהיה גבוה. עם זאת, אם צפיפות הנוגדנים נמוכה מהמספר הצפוי (מולקולת נוגדנים 1E+04), סיכויי הקישור בין התא לבין NWs יהיו נמוכים יותר.</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 3: חישוב מספר הנוגדנים על ננו-חוט.

Watch this Scientific Journal Video about Biofunctionalization of Magnetic Nanomaterials at JoVE.com

Biofunctionalization of Magnetic Nanomaterials

בעבודה זו, אנו מספקים פרוטוקול לתפקוד ביולוגי של ננו-חומרים מגנטיים עם נוגדנים עבור מיקוד תאים ספציפיים. כדוגמאות, אנו משתמשים בננו-חוטי ברזל כדי לתקוף תאים סרטניים.

ביו-פונקציונליזציה של ננו-חומרים מגנטיים

Magnetic nanomaterials have received great attention in different biomedical applications. Biofunctionalizing these nanomaterials with specific targeting ...

biofunctionalization-of-magnetic-nanomaterials

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

2.5K Views.  King Abdullah University of Science and Technology. בעבודה זו, אנו מספקים פרוטוקול לתפקוד ביולוגי של ננו-חומרים מגנטיים עם נוגדנים עבור מיקוד תאים ספציפיים. כדוגמאות, אנו משתמשים בננו-חוטי ברזל כדי לתקוף תאים סרטניים.

Video: Biofunctionalization of Magnetic Nanomaterials

Synthesis of Immunotargeted Magneto-plasmonic Nanoclusters

Magnetic and plasmonic properties combined in a single nanoparticle provide a synergy that is advantageous in a number of biomedical applications including contrast enhancement in novel magnetomotive imaging modalities, simultaneous capture&#160;and detection of circulating tumor cells (CTCs),&#160;and multimodal molecular imaging combined with photothermal therapy of cancer cells. These applications have stimulated significant interest in development of protocols for synthesis of magneto-plasmonic nanoparticles with optical absorbance in the near-infrared (NIR) region and a strong magnetic moment. Here, we present a novel protocol for synthesis of such hybrid nanoparticles that is based on an oil-in-water microemulsion method. The unique feature of the protocol described herein is synthesis of magneto-plasmonic nanoparticles of various sizes from primary blocks which also have magneto-plasmonic characteristics. This approach yields nanoparticles with a high density of magnetic and plasmonic functionalities which are uniformly distributed throughout the nanoparticle volume. The hybrid nanoparticles can be easily functionalized by attaching antibodies through the Fc moiety leaving the Fab portion that is responsible for antigen binding available for targeting.

Here, we describe a protocol for synthesis of magneto-plasmonic nanoparticles with a strong magnetic moment and a strong near-infrared (NIR) absorbance. The protocol also includes antibody conjugation to the nanoparticles through the Fc moiety for various biomedical applications which require molecular specific targeting.

Nanoclusters סינתזה של Immunotargeted מגנטתי plasmonic

Magnetic and plasmonic properties combined in a single nanoparticle provide a synergy that is advantageous in a number of biomedical applications ...

Chemistry

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Biofunctionalized הכחול פרוסים חלקיקים ליישומי הדמיה מולקולריים Multimodal

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

המצאה של ננוצלולוז בקטריאלי המגנטי פונקציונלי עם חלקיקים של תחמוצת ברזל

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the target site while minimizing deleterious effects to off-target sites. Magnetic cell targeting is an efficient, safe, and straightforward delivery technique. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) are biodegradable, biocompatible, and can be endocytosed into cells to render them responsive to magnetic fields. The synthesis process involves creating magnetite (Fe3O4) nanoparticles followed by high-speed emulsification to form a poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) coating. The PLGA-magnetite SPIONs are approximately 120 nm in diameter including the approximately 10 nm diameter magnetite core. When placed in culture medium, SPIONs are naturally endocytosed by cells and stored as small clusters within cytoplasmic endosomes. These particles impart sufficient magnetic mass to the cells to allow for targeting within magnetic fields. Numerous cell sorting and targeting applications are enabled by rendering various cell types responsive to magnetic fields. SPIONs have a variety of other biomedical applications as well including use as a medical imaging contrast agent, targeted drug or gene delivery, diagnostic assays, and generation of local hyperthermia for tumor therapy or tissue soldering.

Targeted cell delivery is useful in a variety of biomedical applications. The goal of this protocol is to use superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) to label cells and thereby enable magnetic cell targeting approaches for a high degree of control over cell delivery and localization.

תיוג תא ומיקוד עם פאראמגנטי תחמוצת ברזל חלקיקים

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection

In the present work, the synthesis of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) and its conjugation with deferoxamine, a siderophore recognized by Yersinia enterocolitica, using a succinyl moiety as a linker are described.
Magnetic nanoparticles (MNP) of magnetite (Fe3O4) were prepared by solvothermal method and coated with SiO2 (MNP@SiO2) using the St&#246;ber process followed by functionalization with APTES (MNP@SiO2@NH2). Then, feroxamine was conjugated with the MNP@SiO2@NH2 by carbodiimide coupling to give MNP@SiO2@NH2@Fa. The morphology and properties of the conjugate and intermediates were examined by eight different methods including powder X-Ray diffraction (XRD), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), Raman spectroscopy, X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), transmission electron microscopy (TEM) and energy dispersive X-Ray (EDX) mapping. This exhaustive characterization confirmed the formation of the conjugate. Finally, in order to evaluate the capacity and specificity of the nanoparticles, they were tested in a capture bacteria assay using Yersinia enterocolitica.

This work describes protocols for the preparation of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) and its conjugation with deferoxamine using a succinyl moiety as a linker. A deep structural characterization description and a capture bacteria assay using Y. enterocolitica for all the intermediate nanoparticles and the final conjugate are also described in detail.

סינתזה של חלקיקי חלקיקים מגנטיים, הקוניוגציה שלהם עם הסידרפפור פראאוקמין והערכתה לאיתור חיידקים

In the present work, the synthesis of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

סינתזה של Cationized Magnetoferritin עבור המגנטיזציה אולטרה-מהירה של תאים

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

צבירת Cell מגנטי גזע 3D והתבגרות Bioreactor להתחדשות סחוס

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Stable Aqueous Suspensions of Manganese Ferrite Clusters with Tunable Nanoscale Dimension and Composition

Manganese ferrite clusters (MFCs) are spherical assemblies of tens to hundreds of primary nanocrystals whose magnetic properties are valuable in diverse applications. Here we describe how to form these materials in a hydrothermal process that permits the independent control of product cluster size (from 30 to 120 nm) and manganese content of the resulting material. Parameters such as the total amount of water added to the alcoholic reaction media and the ratio of manganese to iron precursor are important factors in achieving multiple types of MFC nanoscale products. A fast purification method uses magnetic separation to recover the materials making production of grams of magnetic nanomaterials quite efficient. We overcome the challenge of magnetic nanomaterial aggregation by applying highly charged sulfonate polymers to the surface of these nanomaterials yielding colloidally stable MFCs that remain non-aggregating even in highly saline environments. These non-aggregating, uniform, and tunable materials are excellent prospective materials for biomedical and environmental applications.

We report a one-pot hydrothermal synthesis of manganese ferrite clusters (MFCs) that offers independent control over material dimension and composition. Magnetic separation allows rapid purification while surface functionalization using sulfonated polymers ensures the materials are non-aggregating in biologically relevant medium. The resulting products are well positioned for biomedical applications.

מתלים מימיים יציבים של אשכולות פריט מנגן עם ממד ננומטרי טונה והרכב

Manganese ferrite clusters (MFCs) are spherical assemblies of tens to hundreds of primary nanocrystals whose magnetic properties are valuable in diverse ...

Using Magnetometry to Monitor Cellular Incorporation and Subsequent Biodegradation of Chemically Synthetized Iron Oxide Nanoparticles

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized in cells and then left within. One challenge is to assess their fate in the intracellular environment with reliable and precise methodologies. Herein, we introduce the use of the vibrating sample magnetometer (VSM) to precisely quantify the integrity of magnetic nanoparticles within cells by measuring their magnetic moment. Stem cells are first labeled with two types of magnetic nanoparticles; the nanoparticles have the same core produced via a fast and efficient microwave-based nonaqueous sol gel synthesis and differ in their coating: the commonly used citric acid molecule is compared to polyacrylic acid. The formation of 3D cell-spheroids is then achieved via centrifugation and the magnetic moment of these spheroids is measured at different times with the VSM. The obtained moment is a direct fingerprint of the nanoparticles&#8217; integrity, with decreasing values indicative of a nanoparticle degradation. For both nanoparticles, the magnetic moment decreases over culture time revealing their biodegradation. A protective effect of the polyacrylic acid coating is also shown, when compared to citric acid.

Iron oxide nanoparticles are synthesized via a nonaqueous sol gel procedure and coated with anionic short molecules or polymer. The use of magnetometry for monitoring the incorporation and biotransformations of magnetic nanoparticles inside human stem cells is demonstrated using a vibrating sample magnetometer (VSM).

שימוש במגנטומטריה לניטור התאגדות תאית והתפרקות ביולוגית של חלקיקי תחמוצת ברזל מסונתטיים כימית

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized ...

Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons

The ability to direct neurons into organized neural networks has great implications for regenerative medicine, tissue engineering, and bio-interfacing. Many studies have aimed at directing neurons using chemical and topographical cues. However, reports of organizational control on a micron-scale over large areas are scarce. Here, an effective method has been described for placing neurons in preset sites and guiding neuronal outgrowth with micron-scale resolution, using magnetic platforms embedded with micro-patterned, magnetic elements. It has been demonstrated that loading neurons with magnetic nanoparticles (MNPs) converts them into sensitive magnetic units that can be influenced by magnetic gradients. Following this approach, a unique magnetic platform has been fabricated on which PC12 cells, a common neuron-like model, were plated and loaded with superparamagnetic nanoparticles. Thin films of ferromagnetic (FM) multilayers with stable perpendicular magnetization were deposited to provide effective attraction forces toward the magnetic patterns. These MNP-loaded PC12 cells, plated and differentiated atop the magnetic platforms, were preferentially attached to the magnetic patterns, and the neurite outgrowth was well aligned with the pattern shape, forming oriented networks. Quantitative characterization methods of the magnetic properties, cellular MNP uptake, cell viability, and statistical analysis of the results are presented. This approach enables the control of neural network formation and improves neuron-to-electrode interface through the manipulation of magnetic forces, which can be an effective tool for in vitro studies of networks and may offer novel therapeutic biointerfacing directions.

This work presents a bottom-up approach to the engineering of local magnetic forces for control of neuronal organization. Neuron-like cells loaded with magnetic nanoparticles (MNPs) are plated atop and controlled by a micro-patterned platform with perpendicular magnetization. Also described are magnetic characterization, MNP cellular uptake, cell viability, and statistical analysis.

ייצור פלטפורמות מגנטיות עבור ארגון בקנה מידה מיקרון של נוירונים מחוברים

The ability to direct neurons into organized neural networks has great implications for regenerative medicine, tissue engineering, and bio-interfacing. ...