שיטה זו מספקת הוראות שלב אחר שלב כיצד לייצר אורגנואידי מעיים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם על ידי התמיינות לאנדודרם סופי, לאחר מכן אפיתל מעיים אחורי, ולבסוף העברה לתנאי תרבית תלת-ממדיים. תוצאות שהתקבלו מאורגנואידי מעיים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע המושרים על ידי בני אדם מדגימות יכולת תרגום גבוהה יותר מאשר נתונים מתרביות חד-תאיות, תוך שהן גם מעשיות יותר מאורגנואידים ראשוניים שמקורם ברקמות, שיכולים להיות קשים לשמירה בתרבית לטווח ארוך. עם יצירת תאי מעיים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מובחנים (iPSCs), השתמשו בפיפטה סרולוגית של 5 מיליליטר כדי לנתק את חד-שכבת התא מכל באר של צלחת 6 הקידוחים.
ולאגד את התאים בצינור יחיד של 15 מיליליטר לצנטריפוגה. יש להשהות מחדש את הגלולה במדיום גדילת המעי בתוספת גורמי גדילה. ולהוסיף את הנפח המתאים של מטריצה חוץ-תאית בהתאם למספר הבארות המצופות.
הוסף 30 מיקרוליטר של השעיית התא למרכז המספר המתאים של בארות של צלחת 48 בארות. הבטחת מיקום ה- ECM במרכז הבאר חשובה מאוד ליציבות ארוכת הטווח של הדגימה הזו. אם ה-ECM נוגע בדופן הבאר, הוא עלול להתמוטט והדגימות עלולות ללכת לאיבוד.
מניחים את הצלחת באינקובטור תרבית התא למשך 5 דקות לפחות. כאשר המטריצה החוץ תאית שקעה, מוסיפים 300 מיקרוליטר של מצע גידול מעיים טרי בתוספת גורמי גדילה לכל באר, ומחזירים את הצלחת לאינקובטור תרבית התא. לאחר 48 שעות, השתמש במיקרוסקופ אור כדי לבדוק את הבארות להיווצרות אורגנואידים.
לאחר 7 ימים של תרבות, שאפו את מדיה התרבות והחליפו אותה ב- DPBS קר כקרח. השתמש פיפטה סרולוגית 5 מיליליטר כדי לנתק מכנית את האורגנואידים ואת כדור המטריקס החוץ תאי מהצלחת. לאחר מכן, אגרו את האורגנואידים לתוך צינור צנטריפוגה יחיד של 15 מיליליטר.
אספו את האורגנואידים באמצעות צנטריפוגה ושאפו את הסופרנאטנט עד לראש שכבת ה-ECM הנראית לעין. השהה מחדש את הגלולה ב -15 מיליליטר של DPBS קר כקרח וצנטריפוגה את התאים שוב. לאחר שאיפת הסופרנאטנט כפי שהודגם, השהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של PBS קר כקרח והשתמש בפיפט P200 כדי לשבש ידנית את האורגנואידים השלמים.
אשר דיסוציאציה מלאה של האורגנואידים. סובבו את האורגנואידים המנותקים והשהו מחדש בנפח הנדרש של המטריצה החוץ-תאית לפני הציפוי על צלחת טרייה בת 48 בארות, כפי שהודגם בכך. לאחר מכן, להחזיר את הצלחת לאינקובטור במשך 5 דקות.
לאחר 5 דקות, להסיר את הצלחת מן האינקובטור ולהוסיף מדיה בסיסית המעי עם גורמי גדילה מעכב ROCK. החליפו מדיה כל 2-4 ימים. כדי לעורר תגובה דלקתית באורגנואידים של המעי, החליפו את הסופרנאטנט בכל באר של תרבית האורגנואידים ב-300 מיקרוליטר של מדיום בסיסי טרי שהוכן בתוספת 40 ננוגרם למיליליטר של TNF אלפא.
לאחר מכן, החזירו את הצלחת לאינקובטור תרבית התאים למשך 48 שעות כדי לשכפל סביבה פרו-דלקתית. ניתן לנטר ביטוי גנים במהלך התמיינות IPSC אנושית באמצעות סמנים פלוריפוטנטיים המתבטאים מאוד ביום 0 ומווסתים במהירות במהלך תהליך התמיינות אנדודרם סופי. ביום 2 להתמיינות, גנים אנדודרם סופיים צריכים להתחיל לבוא לידי ביטוי, והביטוי צריך להגיע לשיא ביום 3.
במהלך אפיון המעי האחורי, ביטוי CDX2 ו- HNF4alpha צריך להיות מושרה ולהגדיל עם הזמן. 48 שעות לאחר העברת גיליון תאים דו-ממדי, יריעות התאים אמורות להתחיל להתארגן אוטומטית למבנים ספרואידים תלת-ממדיים דחוסים יותר, שהם בתחילה קטנים, אך יגדלו בהדרגה בגודל ובמורכבות במהלך 7-10 ימי התרבית הבאים. אין להעביר את האורגנואידים עד שהם השיגו מורפולוגיית אורגנואיד ספרואידית ברורה עם אפיתל ברור ועם לומן הפונה לכיוון מרכז המבנה.
כאשר המבנים מגיעים לשלב זה, אימונוציטוכימיה יכולה להתבצע כדי לאשר את הביטוי של סמני מעיים, כגון villin ו- CDX2. כדי למדל דלקת, ניתן להוסיף TNF אלפא למדיום תרבית הרקמה למשך 24-48 שעות, מה שבדרך כלל גורם לביטוי של סמנים פרו-דלקתיים בשילוב עם ירידה בוויסות של סמני אפיתל במעי. אורגנואידי מעיים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם יכולים לשמש לגילוי תרופות, מידול מחלות, עריכת גנים, מחקר של מיקרו-סביבה של הגידול, ופרופיל שעתוק ופרוטאומי, ואפיגנטי של כל מחלה מעניינת.
שיטה זו יכולה לסייע למעבדות רבות לבסס אורגנואידים במעי כמערכת מודל, ולספק להם שיטה נוספת למחקרם.
