Este método proporciona instrucciones paso a paso sobre cómo generar organoides intestinales derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos mediante la diferenciación en endodermo definitivo, luego en epitelio intestinal posterior y, finalmente, la transferencia a condiciones de cultivo 3D. Los resultados obtenidos a partir de organoides intestinales derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos demuestran una mayor traducibilidad que los datos de cultivos monocelulares, a la vez que son más prácticos que los organoides derivados de tejidos primarios, que pueden ser difíciles de mantener en cultivo a largo plazo. Tras la generación de células intestinales humanas a partir de iPSC diferenciadas, utilice una pipeta serológica de 5 mililitros para separar la monocapa celular de cada pocillo de la placa de 6 pocillos.
Y agrupar las células en un solo tubo de 15 mililitros para la centrifugación. Vuelva a suspender el gránulo en un medio de crecimiento intestinal suplementado con factores de crecimiento. Y agregue el volumen apropiado de matriz extracelular de acuerdo con el número de pocillos que se están sembrando.
Agregue 30 microlitros de la suspensión celular al centro del número apropiado de pocillos de una placa de 48 pocillos. Asegurarse de que el ECM se coloque en el centro del pocillo es muy importante para la estabilidad a largo plazo de esa muestra. Si el ECM toca la pared del pocillo, puede colapsar y las muestras pueden perderse.
Coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares durante al menos 5 minutos. Cuando la matriz extracelular se haya endurecido, agregue 300 microlitros de medio de crecimiento intestinal fresco suplementado con factores de crecimiento a cada pocillo y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular. Después de 48 horas, use un microscopio óptico para verificar la formación de organoides en los pocillos.
Después de 7 días de cultivo, aspire el medio de cultivo y reemplácelo con DPBS helado. Utilice una pipeta serológica de 5 mililitros para separar mecánicamente los organoides y la esfera de la matriz extracelular de la placa. Luego, agrupe los organoides en un solo tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Recoja los organoides por centrifugación y aspire el sobrenadante hasta la parte superior de la capa visible de ECM. Vuelva a suspender el gránulo en 15 mililitros de DPBS helado y vuelva a centrifugar las células. Después de aspirar el sobrenadante como se ha demostrado, vuelva a suspender el gránulo en 1 mililitro de PBS helado y use una pipeta P200 para interrumpir manualmente los organoides intactos.
Confirme una disociación completa de los organoides. Centrifugar los organoides disociados y volver a suspenderlos en el volumen requerido de la matriz extracelular antes de colocarlos en una placa fresca de 48 pocillos, como se ha demostrado. Luego, regrese la placa a la incubadora durante 5 minutos.
Después de 5 minutos, retire la placa de la incubadora y agregue medios basales intestinales con factores de crecimiento e inhibidor de ROCK. Cambie los medios cada 2-4 días. Para desencadenar una respuesta inflamatoria en los organoides intestinales, reemplace el sobrenadante en cada pocillo del cultivo de organoides con 300 microlitros de medio basal recién preparado suplementado con 40 nanogramos por mililitro de TNF alfa.
Luego, regrese la placa a la incubadora de cultivos celulares durante 48 horas para replicar un entorno proinflamatorio. La expresión génica se puede monitorizar a lo largo de la diferenciación de IPSC humana utilizando marcadores de pluripotencia que se expresan en gran medida en el día 0 y se regulan rápidamente a la baja durante el proceso de diferenciación definitiva del endodermo. En el día 2 de diferenciación, los genes definitivos del endodermo deben comenzar a expresarse, y la expresión debe alcanzar su punto máximo en el día 3.
Durante la especificación del intestino posterior, la expresión de CDX2 y HNF4alfa debe inducirse y aumentar con el tiempo. 48 horas después de la transferencia de la lámina celular 2D, las láminas de células deben comenzar a autoorganizarse en estructuras esferoides 3D más compactadas que inicialmente son pequeñas, pero que aumentan gradualmente en tamaño y complejidad durante los próximos 7-10 días de cultivo. Los organoides no deben ser transitados hasta que hayan alcanzado una morfología esferoide organoide clara con epitelio evidente y con el lumen orientado hacia el centro de la estructura.
Cuando las estructuras alcanzan esta etapa, se puede realizar inmunocitoquímica para confirmar la expresión de marcadores intestinales, como la vellosidad y el CDX2. Para modelar la inflamación, se puede añadir TNF alfa al medio de cultivo de tejidos durante 24-48 horas, lo que suele dar lugar a la expresión de marcadores proinflamatorios junto con la regulación a la baja de los marcadores epiteliales intestinales. Los organoides intestinales derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos se pueden utilizar para el descubrimiento de fármacos, el modelado de enfermedades, la edición de genes, el estudio del microambiente tumoral y el perfil transcriptómico, proteómico y epigenético de cualquier enfermedad de interés.
Este método puede ayudar a muchos laboratorios a establecer organoides intestinales como un sistema modelo, proporcionándoles un método adicional para su investigación.
