בסיס אלקטרוכימי מבוסס-מיניאונציה עבור גרסאות חלבון MeCP2

ECLIA היא שיטה פשוטה אך יעילה לכמת רמות הסלולר של MeCP2. ה- ECLIA מהיר, רגיש יותר וקל יותר לטיפול בהשוואה לשיטות כימות אחרות כגון הכתם המערבי וה- ELISA. להכנת פתרון הכביסה, שהוא 0.5%Tween 20 ב-PBS, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של Tween 20 לליטר אחד של PBS והתערבבו במרץ.

הכינו פתרון חסימה של 3%Blocker A ו-PBS ומערבבים בעדינות. לעקר את פתרון החסימה על ידי סינון. כדי להכין את פתרון דילואנט ההקדמה, 1%חוסם A ו- PBS, הוסף חמישה מיליליטר של פתרון חסימה ל- 10 מיליליטר של PBS.

הבא להפשיר את העכבר חד שבטי נגד MeCP2 נוגדן על קרח. מערבבים 0.67 מיקרוליטרים של הנוגדן עם ארבעה מיליליטר של PBS, ואז מערבולת הפתרון. כדי לתת מענה לצלחת ה-96 היטב, מחלקים בזהירות 25 מיקרוליטרים של תותב ציפוי לפינה התחתונה של כל באר, באמצעות צינור רב-ערוצי.

לטבול את הצלחת 96 היטב בעדינות בכל צד כדי להבטיח כי פתרון הציפוי מכסה את החלק התחתון של כל באר. לאטום את הצלחת עם רדיד דבק, ו דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס. מוציאים מהמקרר את צלחת ה-96 באר ומסירים את נייר הכסף.

הסר את פתרון ציפוי הנוגדנים בארות על ידי הפלתו לתוך מיכל פסולת. לאחר מכן הקישו על הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר כל פתרון שנותר. לאחר מכן, להוסיף 125 microliters של פתרון חסימה לכל באר.

ואז לאטום את הצלחת שוב עם רדיד דבק. מניחים את הצלחת על שייקר מיקרופלסטיק מסלולי, להגדיר ב 800 סל"ד, ולהדקר אותו במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. הפשר על קרח בקבוקון אחד של פתרון מלאי החלבון MeCP2 או Tat-MeCP2, לייסאטים של מוח העכבר וליזטס HDF.

לדלל את פתרון מלאי החלבון בצינורות נקיים כמתואר בטבלה 2 של כתב היד. לאחר מכן לדלל את דגימות ליט. עבור lysates המוח העכבר, להשתמש 1 עד 20 מיקרוגרם לכל 25 microliters של מאגר תזה.

עבור ליאזט HDF, הוסף 0.25 למיקרוגרם אחד לכל 25 מיקרוליטרים של מאגר תיזה. לאחר צלחת 96 באר כבר דגירה במשך 90 דקות, להסיר את פתרון החסימה מן בארות על ידי הבהבה אותו לתוך מיכל פסולת. לאחר מכן הקישו על הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר כל פתרון שנותר.

לאחר מכן לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם 150 microliters של פתרון כביסה, על ידי הוספת פתרון הכביסה ומיד להסיר אותו. הוסיפו 25 מיקרוליטרים של תקנים ודגימות ל בארות של צלחת 96 בארות. לאטום את הצלחת ולהדקר אותו עוד ארבע שעות בטמפרטורת החדר עם קבוע 800 סל"ד רועד.

להפשיר את נוגדן גילוי ללא תווי, ארנב polyclonal נגד MeCP2, על קרח. באמצעות פתרון diluent assay, לדלל את הנוגדן ביחס של אחד עד 6, 000. כאשר צלחת 96 באר הוא סיים דגירה על שייקר, להסיר את הסטנדרטים ואת הדגימות על ידי הפלת הצלחת לתוך מיכל פסולת.

לאחר מכן הקישו על הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר כל פתרון שנותר. לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם 150 microliters של פתרון כביסה על ידי הוספת פתרון הכביסה ומיד להסיר אותו. הוסיפו 25 מיקרוליטרים של פתרון נוגדנים לגילוי ללא חגורה לכל באר עם הצינור הרב-ערוצי.

לאטום את הצלחת ולהדקר אותו במשך שעה בטמפרטורת החדר עם רעידות קבועות ב 800 סל"ד. השג את הנוגדן המשני הספציפי מהמקרר והצב אותו בקרח אחד. מדללים את הגוף המשני בתווית מדוללת ומערבבים בעדינות.

כדי להסיר את נוגדן הגילוי ללא תריס מהצלחת 96 באר, החלק לתוך מיכל הפסולת ולאחר מכן הקש על הצלחת על מגבת נייר. לאחר שטיפת הצלחת שלוש פעמים כפי שתואר בצורה סוטה, להוסיף 25 microliters של נוגדן משני לכל באר עם צינור רב ערוצי. לאטום את הצלחת ולהדקר אותו במשך שעה בטמפרטורת החדר עם רעידות קבועות ב 800 סל"ד.

הסר את הנוגדן המשני החופשי על ידי החלקה לתוך מיכל הפסולת והקשה על הצלחת על מגבת נייר ולאחר מכן לשטוף את הצלחת שלוש פעמים, כפי שתואר קודם לכן. לכל באר של הצלחת, להוסיף 150 microliters של 1X טריס בסיס זהב לקרוא Buffer עם פעילי שטח, המכיל טריפרוליאמין כמו coreactant עבור דור האור. כדי להימנע מיפקת בועות אוויר, השתמש בטכניקות צינורות הפוכות.

מניחים את לוחית 96 באר על פלטפורמת microplate עם מערכת זיהוי electrochemiluminescence. באמצעות מצלמת CCD המובנית, התחל מיד ללכוד נתונים. ספירת אותות הקלטה התואמת ליחידות אור יחסיות והן פרופורציונליות ישירות לעוצמת האור.

עקומות סטנדרטיות MeCP2 נוצרו MeCP2 אנושי במדידות מרובות. ECLIA יכול לכמת במדויק MeCP2 אנושי רקומביננטי על פני טווח של ננוגרם אחד למיליליטר ל 1800 ננוגרם למיליליטר. באמצעות ECLIA, רמות החלבון MeCP2 נמדדו lysates גרעיני במוח מעכברים הטרוזיגים ונקבה מסוג פראי מעכבר נוקאאוט אחד MeCP2.

ECLIA נערך על ליזטים התא מתוך שליטה בריאה מן קו התאים c. 806delG המשמש כמודל לתסמונת רט. לא זוהה חלבון MeCP2 בקווי התאים המוטנטים על ידי ECLIA או על ידי שפעת חיסונית.

ECLIA שימש גם כדי לחקור את ספיגת Tat-MeCP2 על ידי קו תאים לקוי MeCP2 שעות נוספות. דיוק האינטר והאינטרא-תדאה הפנימית של ECLIA נקבע במשך שלושה ימים רצופים. לטיפול עתידי בתחליפי חלבון, ניתן לייעל שוב ושוב את אספקת MeCP2 לאחר הערכת רמת החלבון על ידי ECLIA.