שיטה זו מספקת גישה אידיאלית לחקר ריפוי פצעים המעי הגס ואת השינויים המולקולריים וההיסטולוגיים המתרחשים לאחר פציעה. שיטה זו יכולה גם לשפוך אור על פתוגנזה IBD. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא לשלוט במדויק על מיקום הפציעה ועל עיתוי תהליך ריפוי הפצע.
אנשים המבצעים שיטה זו בפעם הראשונה עשויים להתקשות להכניס את העמוד המעי הגס לתוך המעי הגס של העכבר וליצור פצעים עקביים. תרגול חוזר ונשנה של טכניקות אלה צריך להתגבר על נושאים אלה. בהתחשב בצעדים מתואמים מרובים וניואנסים המעורבים בהליך זה, הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית.
לפני תחילת ההליך, להכניס אנדוסקופ נשא נוקשה 1.9 מילימטר לתוך נדן אנדוסקופ. ולחבר את אנדוסקופ התאספו למקור האור התקן הדמיית וידאו לפי הוראות היצרן. השתמש בצינורות שסופקו כדי לחבר את משאבת האוויר לשסתום הגז בצד שמאל של הנדן ליד ערוץ העבודה.
ודא כי ערוץ העבודה נמצא בעמדה פתוחה והכנס שלוש מלקחיים ביופסיה צרפתית דרך ערוץ העבודה. קדם את המלקחיים לסוף הנדן מבלי לבלוט מתוך הנדן. לאחר מכן, הנח את העכבר מורדם על פלטפורמת היערכות אנדוסקופית בצד הגחוני שלה ולאשר את הרמה המתאימה של הרדמה על ידי חוסר תגובה לרפלקס הדוושה.
לאחר החלת משחת עיניים, למלא מזרק שלושה מיליליטר עם מחט gavage עכברוש מצורף עם PBS טמפרטורת החדר. ולהכניס את המחט בערך סנטימטר אחד לתוך פי הטבעת של העכבר. יש להחדיר בעדינות באמצעות PBS עד ל ניקוי החומר הצואה.
כמה כדורי צואה צריך לצאת העכבר יחד עם PBS כי היה חדורים. הכנס את האנדוסקופ המורכב 0.5 ס"מ לתוך פי הטבעת ולקדם את מלקחיים ביופסיה לתוך לומן פינה של פי הטבעת עד לסתות מלאות של המלקחיים הם מעבר לקצה הנדן. סובבו את המלקחיים ב-90 מעלות כך שהלסתות ייפתחו בכיוון מזרח-מערב ויפתחו את הטיפים ותקדם את המלקחיים בסנטימטר אחד, ותסגור ותבטל את המלקחיים בתנועה חלקה ומהירה אחת כדי לקצור את הביופסיה.
כדי למנוע סיומת מלאה של המעי הגס בעת ביצוע הביופסיה, להשאיר את הצד הימני של שסתום הגז פתוח. מיד לאחר הביופסיה, לדכא את דוושת הרגל המחוברת למכשיר ההקלטה קולונוסקופ ליזום את הקלטת וידאו. ולחץ בחוזקה אצבע המורה על הצד הימני של שסתום הגז כדי לכסות לחלוטין את הפתח, לאלץ אוויר לתוך אנדוסקופ ובכך לתוך המעי הגס.
לסגת המלקחיים בחזרה מן הנדן לתוך לומן רקטלי בזמן במצב סגור. ומניחים את המלקחיים על הקיר רקטלי מיד מעל הפצע עד הבסיס של הלסתות מיושר עם הקצה העליון של שדה הצפייה. ממשיכים בהסתעפות מלאה של המעי הגס עד שניתן יהיה להבחין בתצוגה ברורה של הפצע.
כדי לקבל את המדידות הטובות ביותר של מיטת הפצע, להיות סבלני ולאחר מכן למקם את קולונוסקופ בזווית מדויקת, כך שאתה מקבל את התמונה הטובה ביותר של מיטת הפצע. פתח את הווידאו בתוכנה מתאימה ולקדם את הווידאו למסגרת המציגה נקודת זמן שבה ניתן לדמיין בקלות את מיטת הפצע. ושם המלקחיים הסגורים נמצאים מעל מיטת הפצע ועל הקיר רקטלי, והקיר מתוח.
בכל נקודת זמן, לקבל תמונה של מסגרת זו קוד שם הקובץ כדי להבטיח כי המדידות של מיטות הפצע מתבצעות בצורה עיוורת. כדי לכמת את גודל מיטת הפצע, פתח את התמונות ב- ImageJ והשתמש בכלי בחירות יד חופשית כדי לצייר היקף סביב הפצע. תחת נתח, בחר מדידה.
והערך של מדידה זו יאוכלס באופן אוטומטי בחלון תוצאות. כאשר כל המדידות נרכשו, לחשב את גודל הפצע בימים הבאים ביחס לגודל ביום אפס בגיליון אלקטרוני. בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, פתחו את שכבות העור ושרירי הבטן כדי לחשוף את חלל הגוף של החיה הניסיונית והניחו מלקחיים סגורים מתחת למעי הגס.
בעדינות להרים את המעי הגס כדי לשחרר אותו מן mesentery הבסיסית לחתוך את הרקמה בנקודת האמצע שלה פי הטבעת כדי לאסוף אותו מן העכבר. השתמש במזרק 20 מיליליטר מלא PBS קר כקרח ומצויד במחט gavage חולדה כדי לשטוף את תכולת הצואה. ומניחים את המעי הגס המנוקה על פיסת נייר סינון.
פתח את המעי הגס longitudinally, דואג כי הצד mesenteric הוא עם הפנים כלפי מטה נגד נייר המסנן. ולהשתמש פיפטה פסטר כדי לכסות את הרירית עם 0.2% כחול מתילן. לאחר מספר שניות, יש לנקז את הכתם העודף ולצפות במעי הגס תחת מיקרוסקופ מנתח כדי לאתר את מיטת הפצע.
השתמש מספריים מיקרו איריס ארבעה אינץ' לחתוך סביב קצה המיטה, נזהר לא לחתוך לתוך שכבת השריר. ולהשתמש פינצטה נקודה בסדר להעביר את הרקמה מנותח לתוך צינור להקפאה הצמד או אחסון. בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, פתח את המעי הגס שנקטף לאורך זמן על פיסת נייר סינון, צד mesenteric למטה.
לכסות בעדינות את הרקמה עם התיקון שלך של בחירה. מכסים את הרקמה בפרפילם במיכל אטום במשך 4 עד 6 שעות לפני האחסון ב-70% אתנול. ביום העיבוד, להסיר את parafilm ולהוסיף 0.2% כחול מתאילן לרקמה, כפי שהוכח.
לאחר ניקוז הכתם העודף, מניחים את הרקמה תחת מיקרוסקופ מנתח כדי לאתר את מיטת הפצע. באמצעות אזמל עם להב מספר 10, לחתוך ישירות דרך מרכז מיטת הפצע ולהמשיך לחתוך דרך שאר המעי הגס בקו ישר, כך המעי הגס נחתך לחצי לאורך. עבור cryosectioning, להטביע את חתיכות המעי הגס כך הצד שנחתך על ידי האזמל הוא עם הפנים כלפי מטה בתבנית בסיס חצי מלא עם רקמות מקפיא בינוני.
אבטחו את הרקמה במקום עם פינצטה עדינה והניחו את תבנית הבסיס על צלחת מתכת או רדיד אלומיניום סמיך על גבי קרח יבש כדי להקשיח את המדיום המקפיא. לאחר החלק התחתון של המדיום קפוא, למלא את הנפח הנותר של תבנית הבסיס עם מדיום מקפיא בטמפרטורת החדר. ולהחזיר את התבנית לקרח היבש עד שכל גוש הרקמות יקפא.
לאחר מכן, מעבירים את התבנית למקפיא של 80 מעלות צלזיוס עד לחיתוך. כאן מוצגות תמונות מייצגות של תצוגות מקובלות של מיטת הפצע לכימות מדויק של גודל מיטת הפצע ושיעור הסגירה של הפצע. בתצוגה זו לשעבר ויוו של מיטת פצע, אינדיקטורים של ההיקף של מיטת הפצע והיכן לחתוך את הרקמה כדי לאפשר הדמיה של מיטת הפצע על חתך ניתן לראות.
בתמונה מייצגת זו, ניתן לראות בבירור קטע כתם H ו- E של מיטת פצע. חשוב לרכוש תמונות מיידיות של מיטת הפצע בכל רגע כדי להבטיח הערכה מדויקת של קצב ריפוי הפצע. בעקבות הביופסיה צביטה, סוכנים שונים של עניין ניתן להזריק לתוך מיטת הפצע כדי לבדוק את ההשפעות שלהם על קצב ריפוי הפצע.
