אנו משתמשים ברצף גנטי של וירוסים כדי לנסות ולהבין מהיכן מגיעים וירוסים וכיצד הם מתפשטים. ועל מנת להשתמש בנתונים אלה בזמן אמת, למשל במהלך התפרצות, עלינו להבין בדיוק עד כמה מדויקים הנתונים שאנו מספקים. היתרונות העיקריים של טכניקות אלה הם שזה זול יחסית, זה מהיר, וזה מאפשר קידוד בסיס בזמן אמת אשר יכול לשמש רצף בשטח.
שיטה זו יכולה לשמש עבור הדור בזמן של נתוני רצף אשר, למשל, ניתן להשתמש כדי לקבוע את המקור של שפע של פתוגנים. טכניקה זו יכולה להיות מורכבת עבור משתמשים בפעם הראשונה וידע בסיסי יוניקס נדרש. במיוחד להתקנת חבילות התוכנה השונות.
הפריט החזותי של שיטה זו יסייע למשתמשים לקבוע את קצב השגיאה של פרוטוקולי רצף ספציפיים שלהם. ולענות על שאלות מחקר. הפעלת הרצף מתחילה במיניון המחובר ל- MinIT.
לאחר ביצוע רצף מראש על פלטפורמת Nanopore, לטעון את עומס הנתונים לתוך Porechop. כדי למנוע זיהום ולשפר את הדיוק, השתמש במקף התחתון שתיים, סמן ברקודים במקף תחתון והזן את הפקודה כמצוין. לאחר ביטול מולטיפלקסינג, השתמש cutadapt כדי להסיר רצפים ורצפים פריימר עם אורך קצר מ 75 נוקלאוטידים באמצעות הפקודה כפי שצוין.
השתמש ב- Minimap2 כדי למפות קריאות רצף דה-מולטיפלקס מול החלונית של זנים שונים של ייחוס באמצעות Minimap2. ולהשתמש Samtools כדי ליצור רצף קונצנזוס. עבור יישורים מבוססי התייחסות, חיוני ליצור מראש פיצוץ ולחפש עם רצף הקונצנזוס שנוצר כדי לזהות את זן הייחוס הקרוב ביותר.
לאחר מכן חזור על היישור המבוסס על הפניה עם זן ההפניה הקרוב ביותר כהפניה. כדי לקבוע את כיסוי הקריאה הנדרש כדי לפצות על פרופיל השגיאה ברצף Nanopore, בחר את מיפוי הרצף לאמפליקון אחד ולהשתמש ב- Minimap2 כדי למפות את קריאות Nanopore נגד אמפליקון זה. השתמש Samtools כדי לבחור רק את מיפוי קריאות Amplicon26 כדי להמיר את קובץ bam לתוך fastq באמצעות הפקודות כפי שצוין.
בחר באופן אקראי קבוצות משנה של, לדוגמה, 200 קריאות רצף אלף פעמים. כל קריאות הרצף שנבחרו באופן אקראי מיושרות ל- Amplicon26. השתמש ב- KMA כדי למפות את קריאות הרצף ולהפיק מיד רצף קונצנזוס באמצעות ההגדרות הממוטבות עבור רצף Nanopore כפי שצוין על ידי דגל הננו BC.
כדי לבדוק את רצפי הקונצנזוס שנוצרו, השתמש בפקודות כמצוין. כדי להציג את קצב השגיאות ב- txt של נקודות הסטטיסטיקה מתחת לכותרת, קצב השגיאות אינו תואם לבסיסים הממופים, השתמש בפקודה כמצוין. כדי להציג את מספר ה- indels מוצג תחת הכותרת indels לכל מחזור השתמש בפקודה כמצוין.
שימוש בתא הזרימה החדש בשילוב עם כפכף צבע הבסיס, כיסוי קריאה של פי 40 מביא לתוצאות זהות בהשוואה לריווח Illumina. כיסוי קריאה של 30 פעמים גורם לקצב שגיאות של 0.02%, התואם לשגיאה אחת בכל רצף של 585,000 נוקלאוטידים. בעוד כיסוי קריאה של 20 פעמים תוצאות שגיאה אחת בכל 63, 529 נוקלאוטידים רצף.
כיסוי קריאה של 10 פעמים גורם לשגיאה אחת בכל רצף של 3, 312 נוקלאוטידים. כלומר, מעל 3 נוקלאוטידים לכל ארבעה גנום וירוס Usutu נקראים לא בסדר. עם כיסוי קריאה מעל 30 פעמים, לא נצפו כופרים.
כיסוי קריאה של 20 פעמים גורם לגילויים של עמדה אחת indel בעוד כיסוי קריאה של 10 פעמים תוצאות indels ב 29 עמדות. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא, אם כי לא תמיד נראה לעין, עדכונים בתוכנה מתרחשים לעתים קרובות והוא יכול להשפיע על התוצאות. קיימות מספר אפשרויות לשימוש בתוכנות.
הדגמנו את התוכניות הנפוצות ביותר. אבל תוכנה שונה וגירסאות שונות של תוכנות אלה עלול לגרום לתוצאות שונות. הראינו לך דוגמה לאופן שבו אנו בודקים את איכות נתוני הרצף שאנו מייצרים.
וזה קריטי לתמיכה אמינה בהתפרצות.
