בפרוטוקול זה, אנו מתארים הליך המכיל שני חלקים. ראשית, שיטת בידול קרטינוציטים דו-מימדית מונוליטורית במבחנה על ידי עיכוב מגע. שנית, האפיון המולקולרי שלה על ידי RNA-seq.
שיטת בידול 2D במבחנה היא פשוטה וקלה לביצוע. זה יכול לשמש כדי ללמוד התברואה אפידרמיס, במיוחד כאשר מספר גדול של תאים נחוצים. לדוגמה, בניתוח אפיגני.
צינור ניתוח RNA-seq מפורט הוא ברור ושקוף עבור חוקרים עם מיומנויות ביואינפורמטיקה בסיסיות, והוא יכול לשמש עבור כל ניתוח RNA-seq בתפזורת. בעת ביצוע פרוטוקול ההידול בפעם הראשונה, יש לזכור כי צפיפות הזריעה יכולה להיות מסובכת. נסה ציפויות זריעה מרובות כדי לגלות איזה מהם עובד הכי טוב עם קו התא שלך.
התחל על ידי הכנת מדיום צמיחה keratinocyte או KGM ו 500 מיליליטר כל מדיום התפשטות מדיום התבוללות על פי הוראות כתב יד. זרע קרטינוציטים ראשוניים בצפיפות של 5 עד 20, 000 תאים לסנטימטר בריבוע ולהוסיף מספיק מדיום התפשטות כדי לכסות את התאים. יומיים לאחר הזריעה, לרענן את התאים עם מדיום התפשטות.
בדוק את התאים באופן קבוע תחת המיקרוסקופ ולרענן מדיום כל יומיים. כאשר התאים מגיעים ל- 90%confluency, גורמים להתביור על-ידי שינוי המדיום למדיום ההתמדה. כדי לאסוף תאים לניתוחי RNA נוספים, שטפו את התאים פעמיים עם DPBS ולאחר מכן הוסיפו מאגר תיזה.
לאסוף תאים בימי ההידול אפס, שתיים, ארבע ושבע. לאחר בידוד RNA, cDNA דו-גדילי יומר וספריות RNA-seq יהיו מוכנות לתרשים הדור הבא. בעקבות הרצף, קריאות הרצף יורדו וי מופו לגנום האנושי.
לאחר הורדה והתקנה של חבילות R, צור טבלת חשבונות מתוך readspergene.out. קבצי כרטיסיות וכתיבת קובץ נתונים לדוגמה המכיל את כל שמות הקבצים, יום ההתביור ונתונים לדוגמה רלוונטיים אחרים. עיין בקבצי הקידוד השלים לקבלת דוגמה.
לאחר מכן השתמש בטבלת הספירה ובנתונים לדוגמה כדי ליצור אובייקט deseq2 המכיל הן את הנתונים הניתנים לספירה והן את הנתונים לדוגמה. לנורמליזציה של ביטויי גנים, נרמל את טבלת הספירה באובייקט deseq2 באמצעות נורמליזציה deseq2RLD או VST. בעוד נורמליזציה RLD הוא המועדף, נורמליזציה VST הוא הרבה יותר מהר.
השתמש בפונקציה dist ב- R כדי להתוות את מרחק הדגימה בהתבסס על התעצמות ספירת הקריאה המנורמלת ולאחר מכן בצע קיבוץ באשכולות hclust בהתבסס על מרחק הדגימה. לאחר מכן, התווה את מפת החום באמצעות פונקציית pheatmap. לבסוף, ליצור ניתוח רכיב עיקרון או התוויית PCA של התעצמות ספירת קריאה מנורמל באמצעות הפונקציה plotPCA של deseq2.
PCA משמש ככלי בניתוח נתוני חקר ונוכל להשתמש בו כדי לדמיין מרחק וקשר בין דגימות שונות. בצע ניתוח ביטוי גנים משתנה מאוד עם הפונקציה rowVars אשר מחלצת את 500 הגנים המשתנים ביותר על ידי הזמנה על השונות בין דגימות מנקודות זמן שונות. לגנים אלה יש את סטיית התקן הגבוהה ביותר של עוצמתם מנורמלת לאורך ימים של התמורות.
בצע קיבוץ באשכולות k-פירושו בגנים המשתנים ביותר כדי לקבץ אותם לפי דפוסי ביטוי שונים. דמיינו את הגנים במפת חום בעזרת חבילת pheatmap. העוצמה המותוות במפת החום היא העוצמה המנורמלת deseq2 עם הערך החציוני מופחת.
צור רשימה של גנים ברקע מבוטא הכולל את כל הגנים עם יותר מ 10 ספירות מדגם אחד ולעשות רשימה עם גנים מכל אשכול. לבסוף, לבצע ניתוח ג'ין אונטולוגיה באמצעות GOrilla. השתמש ברשימת הגנים ברקע כסט הרקע וברשימה של הגנים המשתנים ביותר באשכולות כסט היעד, ולאחר מכן לחץ על מונחי GO מועשרים בחיפוש.
לחלופין, משתמשי R מתקדמים יותר יכולים להשתמש באשכול החבילותProfiler כדי להפוך ניתוח העשרה מונח GO לאוטומטי. קווי Keratinocyte הנגזרים מחמישה אנשים שימשו להתבוללה בניתוחי RNA-seq. ניתוח הרכיבים העיקרי הראה כי קרטינוציטים שעברו התבידול חיבר אך פרופילי ביטוי גנים כוללים ברורים.
גנים משתנים מאוד היו מקובצים כדי לדמיין דינמיקה של ביטויי גנים ודפוסים במהלך ההידול. כל אשכול של גנים היה מיוצג על ידי גנים סימן ההיכר קרטינוציטים ביאור ג'ין אונטולוגיה הראה הבדל ברור בתפקודי הגנים. בניסוי השני, מורפולוגיה של תאים והבדלים בביטוי גנים הושוו בין קרטינוציטים מבקרות בריאות וקווי תאים שמקורם בחולים הנושאים מוטציות P63.
ניתוח הרכיבים העיקריים הראה כי קווי תאי הבקרה פעלו בבירור לפי תבנית ההתברמות, אך תבנית ביטוי הגנים של תאים מוטנטים במהלך ההתברות נשארת דומה במידה רבה לזו של תאים מתרבים או לא מו מופשטים. בניתוח הקיבוץ באשכולות, גנים באשכול אחד היו מוסדרים בתאי בקרה ומוסדרים חלקית בתאי החולה הנושאים מוטציות R204W ו- R279H, אך נשארו גבוהים בתאים הנושאים R304W. גנים אלה עשויים לשחק תפקידים בהתפשטות התא כפי שמוצג על ידי ניתוח ג'ין אונטולוגיה.
אשכול שני גנים הוצגו לראשונה ולאחר מכן למטה מוסדר בתאי בקרה. גנים אלה מעורבים ככל הנראה בהידול קרטינוציטים כמו התבולל אפידרמיס ופונקציות קרטיניזציה היו מועשרים מאוד עבור אשכול זה. גנים באשכול 3 נגרמו רק בסוף ההידול בתאי הבקרה, מה שמצביע על כך שהם עשויים לשחק תפקיד בשכבה החיצונית ביותר של האפידרמיס.
בעת ניתוח נתוני RNA-seq, חשוב לדעת מראש למה לצפות. זה יעזור לך גם עם פרשנות בקרת האיכות ואת העלילה PCA בהערכת אם התוצאות שלך הגיוניות. השיטות שלנו יכולות לשמש לחקר שעתוק גנים הן בביולוגיה אפידרמיס והן במערכות ביולוגיות אחרות.
