עבודה זו נתמכה על ידי תקציב הליבה של p53lab (BMSI, A * STAR) ומענק JCO VIP (A * STAR).

קו התא HEK293 שימש לפרוטוקול והיה מתורבת בינוני הנשר שונה של Dulbecco בתוספת 10% סרום שור עוברי, 2 מ"מ L-גלוטמין, ו 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין. התאים היו תרבית ב 37 °C (69 °F) עם 5% CO2 בסביבה לחה.
1. הערכה כמותית של הפרעה מורכבת eIF4F באמצעות eIF4E:eIF4G604-646 השלמה
<ol><li>תרבות תאים והעברה ארעית של eIF4E:eIF4G604-646 השלמה<ol>
<li>השתמש בתאים מופשרים טריים עם פחות מ -20 קטעים לכל הניסויים. ביום הראשון, קבע את מספר התא באמצעות מונה תאים רגיל וספור את התאים בני קיימא הכולל באמצעות שיטת אי-הכללה כחולהTrypan 13.</li>
		<li>זרעים 6-באר צלחות עם 0.9 - 1.2 x 106 של HEK 293 תאים לבאר ב 2 מ"ל של מדיום צמיחה סטנדרטי. הערה: על מנת להשיג את היעילות הטובה ביותר transfection בתוך קווי התא המצוין לעיל, ודא כי התאים המצולפים הם 70-90% confluent יום לאחר הזריעה.</li>
		<li>בבוקר היום השני, תאים שותף עם SubA-eIF4E ו- eIF4G604-646-SubB פלסמיד באמצעות מגיב transfection מבוסס שומנים (ראה טבלה של חומרים) כמתואר להלן.<ol>
<li>לדלל 9 μL של פתרון מבוסס ליפוזום בצינור המכיל 125 μL של מדיום סרום מופחת ללא פנול אדום (ראה טבלה של חומרים)עבור כל transfection ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
			<li>הכן תערובת הורים של DNA על ידי דילול 3 מיקרוגרם של כל פלסמיד ב 125 μL של מדיום סרום מופחת עבור כל צינור transfection.</li>
			<li>הוסף 12 μL של ריאגנטים משפר לצינור לערבב DNA מאסטר, לערבב היטב ומיד להוסיף את ה- DNA: תערובת מאסטר משפר לכל צינור של ליפוזומים מדוללים ביחס 1:1. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
			<li>מוסיפים את קומפלקס הדנ"א-שומנים לכל באר ומדגירה את התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ל-24 שעות.</li>
		</ol>
</li>
		<li>בבוקר יום 3, לשטוף כל באר עם 1 מ"ל של PBS.</li>
		<li>הסר את PBS ואת תאי הדגירה בכל באר עם 0.3 מ"ל של טריפסין במשך 5 דקות ב 37 °C (69 °F).</li>
		<li>לנטרל טריפסין על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיום סרום מופחת ללא פנול אדום המכיל 0% FCS בכל באר ולהעביר תאים transfected לתוך צינור 15 מ"ל. הערה: פנול אדום יכול להפריע לפעילות לוציפראז; לכן, יש לטפל בתאים משלב זה ואילך במדיום ללא פנול אדום.</li>
		<li>לסובב את התאים במשך 5 דקות ב 290 x g ולשואף את המדיום. Resuspend התאים ב 2 מ"ל של מדיום סרום מופחת ללא פנול אדום המכיל 0% FCS. ספור כמתואר בשלב 1.1.</li>
		<li>זרעים חצץ HEK 293 תאים ב 96 לוחות אטומים היטב בצפיפות של 30,000 תאים לבאר ב 90 μL של בינוני ללא פנול אדום המכיל 0% FCS. על מנת להשיג 3 משכפלים טכניים בתוך אותו ניסוי עבור 3 תרכובות שונות, זרע 60 בארות של הצלחות עם תאים למעט בארות בקצוות.</li>
		<li>מיד לאחר זריעת התאים החצויים, להוסיף 10 μL של 10% פתרון תרכובת DMSO (ראה שלב 1.2).</li>
	</ol></li>
	<li>הכנה מורכבת<ol>
<li>הכן פתרונות מלאי מורכבים של 1 מ"מ על ידי המסת תרכובת הריבית ב- 100% DMSO (v/v). על מנת לקבל 3 משכפלים עבור כל טיטרציה מורכבת, להשתמש 8 μL של פתרון 1 מ"מ מורכבים מלאי. הערה: נפח של תרכובת מלאי 1 mM בשימוש הוא יותר ממה שהוא נחוץ. פעולה זו נעשית כדי לקחת בחשבון שגיאות pipetting אם בכלל.</li>
		<li>בצע דילול סדרתי פי 2 של פתרון תרכובת המניה עם 4 μL של מניית 1 מ"מ לתוך 4 μL של 100% DMSO עבור כל נקודת טיטרציה. הערה: לקבלת טיטרציה מורכבת מלאה, בצע 9 דילולים סדרתיים מהמניה ההתחלתית ב- DMSO של 100%. אם תרכובות מרובות צריך להיבדק, להשתמש צלחת 96 גם פיפטה רב ערוצית כדי להקל על צעד זה ואת הדילולים הבאים.</li>
		<li>הוסף 36 μL של מים סטריליים ברמת HPLC עבור כל נקודה של הדילול הטורי פי 2 כדי להכין 40 μL של פתרונות עבודה 10x ב- 10% DMSO (v/v) (כלומר. 100 מיקרומטר עד 0.39 μM 10% סדרת מניות DMSO יוביל לפתרון סופי של 10 מיקרומטר עד 0.039 מיקרומטר, ב 1% DMSO כאשר הוסיף לתאים). באשר לבקרת טיפול, גם להכין 10% DMSO רק פתרון מלאי במים סטריליים כיתה HPLC.</li>
		<li>הוסף 10 μL של פתרונות עבודה 10x לתאים בצלחת 96 אטום היטב על מנת להניב את הריכוז הסופי המיועד עם ריכוז DMSO שיורית של 1% (v / v) בנפח כולל של 100 μL ודגרת עבור 3 שעות ב 37 °C (70 °F) עם 5% v / v אטמוספרי CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>מבחני השלמה ותכנון של לוציפראז<ol>
<li>לאחר 3 שעות של סימום, להתחיל להכין את ריאגנט מצע לוציפראז על ידי שילוב 1 נפח של מצע עם 19 כרכים של מגיב דילול (ראה הוראות היצרן). הערה: מבחני לוציפראז מבוצעים באמצעות ערכה מסחרית זמינה (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>השתמש פיפטה רב ערוצית להוסיף מיד 25 μL של מגיב מצע.</li>
		<li>לנער את הצלחת ב 350 סל"ד במשך 50 דקות על שייקר מסלולית בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להעריך את הזוהר באמצעות קורא צלחת. כדי לעשות זאת, הגדר את קורא המראה על זוהר ואת מסנן הפליטה על 455. השתמש בגובה מדידה של 6.5 מ"מ עם זמן מדידה של 1 s.</li>
		<li>על מנת לתחת את הכדאיות של התא, להוסיף 33 μL של ריאגנט בדיקת הכדאיות ולאחר מכן למדוד מחדש את הזוהר שוב לאחר 15 דקות בטמפרטורת החדר, באמצעות קורא הצלחת.</li>
		<li>להעריך את הזוהר עם קורא הלוחות על ידי הגדרת קורא המראה על Luminescence ואת מסנן הפליטה על 600 ננומטר. השתמש בגובה מדידה של 6.5 מ"מ עם זמן מדידה של 1 s. הערה: הכדאיות מוערכת על ידי מדידת הרמה התאית של ATP על תמוגת התא לפי הוראות היצרן. Multiplexing אפשרי במקרה זה מאז מבחני הכדאיות משתמש לוציפראז שונה עם אורך גל פליטה שונה.</li>
		<li>השתמש בנתונים כדי לקבוע את ערכי ה- IC50 של כל תרכובת לפי עקומה המתאימה את הנתונים למשוואה עקומה תואמת 4 פרמטרים: Y = ((A-D)/(1+(x/C))) + D הערכים המספריים D ו- A חייבים להיות מוגבלים בתהליך התאמת העקומה: D = ערך זוהר על ציר Y עבור אסימפטוט עקומה מינימלי או רמת תגובה תיאורטית מינימלית הצפויה ממחיצת ההשלמה eIF4E:4G. A = ערך זוהר על ציר Y עבור אסימפטוט עקומה מקסימלית או תגובה ברמה תיאורטית מקסימלית הצפויה ממחיצת ההשלמה eIF4E:4G. הערה: הערך עבור התגובה המינימלית נגזר 1% DMSO (v / v) טיפול בקרה ואת הערך עבור התגובה המקסימלית נגזר התגובה המקסימלית של מעכב mTOR זיקה גבוהה כי יש מישור ללא השפעה על הכדאיות של התא.</li>
	</ol></li>
</ol>2. מתאם eIF4E:eIF4G604-646 עיכוב מבחנים עם הפרעה מורכבת eIF4F בתאים
<ol><li>כדי לאשר כי האות הנמדד על ידי ההסתעפות תואם את ההפרעה הפיזית של אינטראקציה eIF4E-eIF4G על ידי המתחם, תאי זרע כמתואר בשלב 1.1.</li>
	<li>ביום שאחרי, להחליף את המדיום עם 1 מ"ל של מדיום סרום מופחת לא מכיל פנול אדום דגירה במשך 4 שעות עם תרכובת של עניין. להבטיח ריכוז DMSO שיורית של 1% (v / v) בנפח כולל של 1 מ"ל. הערה: על מנת לאפשר בקלות מתאם עם התוצאה, השתמש בריכוזים מורכבים בהתחלה, בנקודת האמצע ונקודת הקצה של עקומת ההשלמה הנמדדת.</li>
	<li>תאי Lyse וביצע m7GTP למשוך למטה כדי לבודד eIF4F ו eIF4E:4EBP1 קומפלקסים. נהלים מפורטים על איך לבצע את הניסוי m7GTP למשוך למטה ניתן למצוא במקום אחר14.</li>
	<li>לזהות m7GTP מאוגד eIF4G, eIF4E ו 4EBP1 רמות החלבון על ידי ניתוח כתם מערבי, ולאחר מכן לתאם הפרעה מורכבת eIF4F עם עיכוב אות בדיקת משלים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+translational+control.">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li><li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+translation+machinery+in+cancer.">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li><li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex:+a+critical+nexus+for+cancer+development.">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li><li>Montanaro, L., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis:+the+role+of+eIF4E.">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E:+A+retrospective.">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li><li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G.">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li><li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G:+comparison+with+eIF4E-binding+protein.">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li><li>Gr&#252;ner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation.">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li><li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1.">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs.">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1:+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1.">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li><li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation.">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819 (2013).</li><li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly.">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40 (2019).</li><li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein-protein+interactions+(PPIs):+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area.">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטה המתוארת במאמר זה משתמשת בהשלמה מבוססת לוציפראז כדי לפקח כמותית על הרכבה מורכבת של eIF4F באמצעות מדידה ישירה של אינטראקציית eIF4G-eIF4E בתאים חיים. סיפקנו פרטים לשימוש במערכת השלמה eIF4E-eIF4G והראינו גם כי המערכת מדויקת ביותר במדידת ניתוק 4EBP1 בתיווך תרופות של אינטראקציה eIF4E-eIF4G16. על ...

שליטה בביטוי גנים ממלאת תפקיד מרכזי בביצוע נכון של תוכניות תאיות כגון התפשטות צמיחה ובידול. מנגנון בקרה רגולטורי יכול להיות מופעל או ברמה של שעתוק גנים או ברמה של תרגום mRNA. בעשור האחרון, זה הפך להיות יותר ויותר ברור כי שליטה תרגום על ידי אפנון של תהליך החניכה ולא את הצעדים המאוחרים יותר של התארכות וסיום יכול לווסת דק סינתזה של תת קבוצות ספציפיות של חלבונים לשחק מגוון רחב של פונקציות ביולוגיות.
תרגום מוגבר של mRNAs המעורבים בהישרדות, תגובות אנטי אוטופגיות ואנטי אפופטוטיות היו מעורבות במספר סוגי סרטן וגם נקשרו באופן סיבתי להפעלה חריגה או לביטוי של גורמי ייזום תרגום1.
קומפלקס eIF4F הוא וסת ראשי של ייזום תרגום. על ידי איגוד מבנה הכובע בקצה 5 'של mRNAs, eIF4F הוא נהיגה גיוס mRNA-ריבוזום הראשונית בתורו הגדלת יעילות תרגום mRNA של mRNAs eukaryotic מתורגם חלש2. eIF4F מתווך תרגום של mRNAs הקשורות לסרטן דווחה עבור מודלים סרטניים רבים מחסה הפעלה חריגה של RAS / MAPK או AKT / TOR מסלולים, מה שמרמז כי תאים סרטניים upregulate eIF4F כדי להגביר את הפעילות שלהם פרו-neoplastic. שיבוש של לולאה זו להאכיל קדימה על ידי עיכוב היווצרות מורכבת eIF4F היא ובכך אסטרטגיה טיפולית מבטיחה מאוד3,4.
קומפלקס eIF4F מורכב (i) eIF4E, יחידת המשנה מחייבת הכובע של eIF4F המקיימת אינטראקציה עם מבנה הכובע שנמצא ב- UTR 5 ' של mRNA, (ii) eIF4A, הליקאז RNA ו- (iii) eIF4G, חלבון הפיגום המקיים אינטראקציה הן עם eIF4A והן עם eIF4E ואשר בסופו של דבר מגייס את תת-יחידת ה- 40S ריבוזומלית5. eIF4G שיוך עם eIF4E הוא צעד הגבלת קצב להרכבה של קומפלקסים eIF4F פונקציונלי והוא מוסדר באופן שלילי על ידי חלבוני מחייב eIF4E (4EBPs, חברים 1, 2 ו 3))6. על ידי מתחרה עם eIF4G מחייב eIF4E באמצעות ממשק המורכב רצפי איגוד eIF4E קנוני ולאקנוני 7,8,9 (אזור פורש aa 604-646 על eIF4E אנושי), 4EBP מפחית את המאגר של eIF4E מעורב באופן פעיל בתרגום ומניעת היווצרות מורכבת eIF4F. יחסי הגומלין של אינטראקציות חלבון חלבון אלה מוסדר בעיקר על ידי היעד היונקים של rapamycin (mTOR)בתיווך זרחון של 4EBP. על גירויים מיטוגניים, mTOR ישירות phosphorylates בני משפחת החלבון 4E-BP, הפחתת הקשר שלהם עם eIF4E ובכך, קידום אינטראקציה eIF4E-eIF4G והיווצרות של קומפלקסים eIF4Fפונקציונלי 10.
למרות המאמץ הגדול בפיתוח תרכובות מיקוד שלמות מורכבת eIF4F, חוסר מבחנים מדידת שיבוש ישיר של אינטראקציה eIF4E-eIF4G בתאים חיים הגביל את החיפוש אחר תרכובות פגע פעיל הסלולר. יישמנו מבחני לוציפראז המבוססים על אנלוגי coelenterazine (למשל, Nanoluc מבוסס משלים assay) כדי לפקח בזמן אמת את המצב של שלמות eIF4F באמצעות האינטראקציה eIF4E-eIF4G. מערכת החלבון המשלים של לוציפראז מורכבת מרסיס חלבון 18 kDa (SubA) ו-11 שברי פפטיד של חומצות אמינו (SubB) המותאמים למינימום שיוך עצמי ויציבות11. לאחר שהתבטא כמוצר היתוך עם eIF4E באורך מלא אנושי ותחום האינטראקציה eIF4E מ eiF4G1 האנושי (aa 604-646), שני חלבוני אינטראקציה יביא את שבר SubA ו SubB לקרבה של זה יגרום להיווצרות של לוציפראז פעיל כי, בנוכחות מצע חדיר לתא, בסופו של דבר יפיק אות זוהר בהיר(איור 1). דיווחנו במקום אחר על הבנייה והאימות של מערכת ההשלמה eIF4E:eIF4G604-646 16.
כאן, אנו מתארים כיצד ניתן להחיל את מערכת ההשלמה eIF4E:eIF4G604-646 (זמינה על פי בקשה) כדי למדוד במדויק הפרעות eIF4E-eIF4G בתיווך 4EBP1 בתאים חיים. בנוסף, אנו מדגימים את התועלת שלה על ידי מדידת ההשפעות של מספר מעכבי mTOR כי הם כיום תחת ניסויים קליניים כמו תרופות טיפוליות לסרטןפוטנציאליים 12. בגלל השפעות מחוץ ליעד לעתים קרובות להסוות פעילות ספציפית לסמים, אנו מתארים גם כיצד צדדיות של eIF4E:eIF4G604-646 מדידת המערכת ניתן להרחיב עם מדידות אורתוגונליות של הכדאיות הסלולר לקחת את אלה בחשבון.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell titer Glo 2.0</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>G9241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>not applcable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUGENE6</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>E2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI Starter Systems</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>N2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>not appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AC-155S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

היווצרות של קומפלקס eIF4F הוכח להיות צומת במורד הזרם מפתח להתכנסות של מסלולי איתות כי לעתים קרובות לעבור הפעלה oncogenic בבני אדם. eIF4F הוא קומפלקס מחייב כובע מעורב בשלב גיוס mRNA-ריבוזום של ייזום תרגום. במודלים תאיים ופרה-קליניים רבים של סרטן, הסרת הפיקוח על eIF4F מובילה לתרגום מוגבר של תת-קבוצות mRNA ספציפיות המעורבות בהתפשטות סרטן ובהישרדות. eIF4F הוא קומפלקס הטרו-טרימרי שנבנה מתוך eIF4E subunit מחייב כובע, eIF4A הליקאז ואת eIF4G subunit פיגומים. קריטי להרכבה של קומפלקסים פעילים של eIF4F היא אינטראקציית החלבון-חלבון בין חלבוני eIF4E ו- eIF4G. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול למדידת הרכבה eIF4F המפקח על המצב של אינטראקציה eIF4E-eIF4G בתאים חיים. eIF4e:4G תא מבוסס חלבון חלבון אינטראקציה assay גם מאפשר שינויים המושרה על ידי התרופה בשלמות מורכבת eIF4F להיות מוערך במדויק ואמין. אנו צופים כי שיטה זו יכולה להיות מיושמת לאימות הפעילות של תרכובות זמינות מסחרית או להקרנה נוספת של תרכובות חדשניות או אופנים כי ביעילות לשבש היווצרות של קומפלקס eIF4F.

על מנת לאמת את הרגישות של מערכת השלמה eIF4E:eIF4G604-646, עיכוב בתיווך 4EBP1 של הרכבה מורכבת eIF4F הוערך באמצעות מעכבי mTOR. על ידי עיכוב mTORC1 זרחון תלוי קינאז של משפחת החלבון 4EBP, עיכוב mTOR משפר את הקשר 4EBP1 ל- eIF4E, ולכן, פירוק eIF4F15. נבדקו שני סוגים של מעכבים שונים מבחינה מכני?...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells at JoVE.com

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למדידת אינטראקציה eIF4E-eIF4G בתאים חיים שיאפשר למשתמש להעריך הפרעה הנגרמת על ידי סמים של דינמיקה מורכבת eIF4F בפורמטי סינון.

ניטור הרכבת eIF4F על-ידי מדידת אינטראקציית eIF4E-eIF4G בתאים חיים

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

monitoring-eif4f-assembly-measuring-eif4e-eif4g-interaction-live

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

3.0K Views.  A*STAR (Agency for Science, Technology and Research). כאן, אנו מציגים פרוטוקול למדידת אינטראקציה eIF4E-eIF4G בתאים חיים שיאפשר למשתמש להעריך הפרעה הנגרמת על ידי סמים של דינמיקה מורכבת eIF4F בפורמטי סינון.

Video: Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs' long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics. 
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged &#945;-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.

In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.

הדמיה חיה לחקר חוסר יציבות microtubule דינמי סרטן השד עמיד taxane

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

וזמינותו הרג ספרואיד על-ידי תאי T המכונית

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL of blood) warrant a poor prognosis and are correlated with shorter overall survival in several cancers (e.g., breast, prostate and colorectal). Currently, the anti-EpCAM-coated magnetic bead-based CTC capturing system is the gold standard test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for enumerating CTCs in the bloodstream. This test is based on the use of magnetic beads coated with anti-EpCAM markers, which specifically target epithelial cancer cells. Many studies have illustrated that EpCAM is not the optimal marker for CTC detection. Indeed, CTCs are a heterogeneous subpopulation of cancer cells and are able to undergo an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) associated with metastatic proliferation and invasion. These CTCs are able to reduce the expression of cell surface epithelial marker EpCAM, while increasing mesenchymal markers such as vimentin. To address this technical hurdle, other isolation methods based on physical properties of CTCs have been developed. Microfluidic technologies enable a label-free approach to CTC enrichment from whole blood samples. The spiral microfluidic technology uses the inertial and Dean drag forces with continuous flow in curved channels generated within a spiral microfluidic chip. The cells are separated based on the differences in size and plasticity between normal blood cells and tumoral cells. This protocol details the different steps to characterize the programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression of CTCs, combining a spiral microfluidic device with customizable immunofluorescence (IF) marker set.

The characterization of circulating tumor cells (CTCs) is a popular topic in translational research. This protocol describes a semi-automatic immunofluorescence (IF) assay for PD-L1 characterization and enumeration of CTCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) patient samples.

Semi-אוטומטי PD-L1 אפיון וספירה של תאים סרטניים במחזור בין שאינם קטנים תאים סרטן ריאות חולים על ידי Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

בתוך שיטת חוץ גופית כדי ללמוד גידול-מקרופאג אינטראקציה

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

הערכה במבחנה של טרנספורמציה אונקוגנית בתאי אפיתל ממ"ר אנושיים

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver cancer, rationalize its rank as the second most common cause of cancer-related death. Preclinical models need to be adapted to recapitulate the human conditions to select the best therapeutic candidates for clinical development and aid the delivery of personalized medicine. Three-dimensional (3D) cellular spheroid models show promise as an emerging in vitro alternative to two-dimensional (2D) monolayer cultures. Here, we describe a 3D tumor spheroid&#160;model which exploits the ability of individual cells to aggregate when maintained in hanging droplets, and is more representative of an in vivo environment than standard monolayers. Furthermore, 3D spheroids can be produced by combining homotypic or heterotypic cells, more reflective of the cellular heterogeneity in vivo, potentially enabling the study of environmental interactions that can influence progression and treatment responses. The current research optimized the cell density to form 3D homotypic and heterotypic tumor spheroids by immobilizing cell suspensions on the lids of standard 10 cm3 Petri dishes. Longitudinal analysis was performed to generate growth curves for homotypic versus heterotypic tumor/fibroblasts spheroids. Finally, the proliferative impact of fibroblasts (COS7 cells) and liver myofibroblasts (LX2) on homotypic tumor (Hep3B) spheroids was investigated. A seeding density of 3,000 cells (in 20 &#181;L media) successfully yielded Huh7/COS7 heterotypic spheroids, which displayed a steady increase in size up to culture day 8, followed by growth retardation. This finding was corroborated using Hep3B homotypic spheroids cultured in LX2 (human hepatic stellate cell line) conditioned medium (CM). LX2 CM triggered the proliferation of Hep3B spheroids compared to control tumor spheroids. In conclusion, this protocol has shown that 3D tumor spheroids can be used as a simple, economical, and prescreen in vitro tool to study tumor-stromal interactions more comprehensively.

Comprehensive in vitro models that faithfully recapitulate the relevant human disease are lacking. The current study presents three-dimensional (3D) tumor spheroid creation and culture, a reliable in vitro tool to study the tumor-stromal interaction in human hepatocellular carcinoma.

מודל ספרואידי תלת מימדי לחקר האינטראקציה בין גידולים סרטניים בקרצינומה הפטוקולרית

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural microenvironment and stromal cell interaction, cannot be entirely replicated with in vitro assays; thus, animal models are critical for investigating and understanding the effects of therapeutic intervention. However, most brain tumor xenografting methods do not produce brain metastases consistently in terms of the time frame and tumor burden. Brain metastasis models generated by intracardiac injection of cancer cells can result in unintended extracranial tumor burden and lead to non-brain metastatic morbidity and mortality. Although intracranial injection of cancer cells can limit extracranial tumor formation, it has several caveats, such as the injected cells frequently form a singular tumor mass at the injection site, high leptomeningeal involvement, and damage to brain vasculature during needle penetration. This protocol describes a mouse model of brain metastasis generated by internal carotid artery injection. This method produces intracranial tumors consistently without the involvement of other organs, enabling the evaluation of therapeutic agents for brain metastasis.

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Most brain metastasis mouse models are complicated by systemic metastases confounding analysis of mortality and therapeutic intervention outcomes. Presented here is a protocol for internal carotid injection of cancer cells that produces consistent intracranial tumors with minimal systemic tumors.

מידול גרורות במוח על ידי הזרקת עורק הצוואר הפנימי של תאים סרטניים

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex vivo drug screenings. However, current adenosine triphosphate (ATP)-based drug screening assays do not capture the complexity of a drug response (cytostatic or cytotoxic) and intratumor heterogeneity that has been shown to be retained in PDTOs due to a bulk readout. Live-cell imaging is a powerful tool to overcome this issue and visualize drug responses more in-depth. However, image analysis software is often not adapted to the three-dimensionality of PDTOs, requires fluorescent viability dyes, or is not compatible with a 384-well microplate format. This paper describes a semi-automated methodology to seed, treat, and image PDTOs in a high-throughput, 384-well format using conventional, widefield, live-cell imaging systems. In addition, we developed viability marker-free image analysis software to quantify growth rate-based drug response metrics that improve reproducibility and correct growth rate variations between different PDTO lines. Using the normalized drug response metric, which scores drug response based on the growth rate normalized to a positive and negative control condition, and a fluorescent cell death dye, cytotoxic and cytostatic drug responses can be easily distinguished, profoundly improving the classification of responders and non-responders. In addition, drug-response heterogeneity can by quantified from single-organoid drug response analysis to identify potential, resistant clones. Ultimately, this method aims to improve the prediction of clinical therapy response by capturing a multiparametric drug response signature, which includes kinetic growth arrest and cell death quantification.

This protocol describes a semi-automated method for medium- to high-throughput organoid drug screenings and microscope-agnostic, automated image analysis software to quantify and visualize multiparametric, single-organoid drug responses to capture intratumor heterogeneity.

בדיקת תרופות אורגנואידיות של גידולים רב-פרמטריים באמצעות הדמיית תאים חיים של Widefield לניתוח בתפזורת ואורגנואיד יחיד

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...