פרוטוקול זה מדגים כיצד לחקור הפרשת תאים באמצעות הדמיה חיה על ידי מיקרוסקופיית TOF ומספק כלים לזיהוי אירועי קיבוץ באשכולות או אזורים של פעילות גבוהה. באמצעות פרוטוקול זה, אנו יכולים ליצור תרבות תאים על משטחים micropattern לנרמל חלוקת תאים ובכך להקל על הטווחים המיוחדים של אירועי הפרשה. תאים מפרישים מגוון של מקרומולקולים המ ממלאים תפקידים חשובים בוויסות המערכת החיסונית.
בסרטן, הפרשה ללא פיקוח משפיעה על שחרורם של אנזימים פרוטאוליטיים המאפשרים פלישה. כימות הפרשה יאפשר לנו להבין טוב יותר הפרשה מושפלת בסרטן ותהליכים דינמיים אחרים כגון הצגת אנטיגן. למרות פרוטוקול ההדמיה והניתוח שלנו הוא פשוט, זה דורש את הדור של תאים בודדים כי הם התפשטו היטב על פיסת micropattern.
בסרטון זה, נדגים כיצד לתרבת תאים על כיסויי מיקרופטרן וכיצד לדמיין ולנתח אירועי הפרשה באמצעות כלים סטטיסטיים מרחביים. כדי להכין כיסויים עבור micropatterning, להפעיל אתנול מעוקר 25 מילימטר קוטר כיסויי זכוכית תחת אור אולטרה סגול עמוק במשך חמש דקות. בעוד הכיסויים מופעלים, להוסיף טיפה אחת 30 microliter של פוליאתילן שתל פוליאתילן גליקול לכל כיסוי על פיסת סרט פרפין בתוך תא לח.
בסוף ההפעלה, מניחים את הכיסויים המופעלים בצד המשטח אל הטיפות ומכסים את התא הלח עבור דגירה של שעה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את הכיסויים פעמיים במים מזוקקים. בזמן שהכיסויים מתייבשים, שטפו מסכת צילום קוורץ פעם אחת עם מים מזוקקים ופעם אחת עם אלכוהול.
יבש את מסכת הצילום עם זרימת אוויר מסוננת ולחשוף את הצד מצופה כרום מסכת צילום עד אור אולטרה סגול עמוק במשך חמש דקות. בסוף התאורה, מוסיפים טיפת מים של 10 מיקרוליטר על הצד מצופה הכרום של כל מסכת צילום ומניחים את צד הפוליאתילן גליקול של כל כיסוי על כל טיפת מים. לאחר הסרת כל מים עודפים, מניחים כיסוי הסרט מעל המגלשות, כדי למנוע התייבשות.
חשוף את הצדדים הצפויים שאינם כרום של מסכות התמונה לאור אולטרה סגול עמוק במשך חמש דקות נוספות לפני הוספת מים עודפים למסכות הצילום כדי להסיר את הכיסויים. שלב זה יפיק את הטבעות המיקרופטרן על פני השטח. ואז להדגיר את הכיסויים בתווית חלבון מטריצה חוץ תאית על סרט פרפין בתא לח במשך שעה אחת מתחת למכסה המנוע לזרימה למינארית.
עבור זריעת תא על פני השטח micropattern מוכן, בסוף הדגירה, למקם את הכיסויים לתוך צד micropattern מחזיק כיסוי מגנטי למעלה מיד להוסיף דפוס בינוני כדי coverslips. לאחר הוספת החותם, יש לשתק את הכיסויים עם ההתקן המגנטי לפני מילוי מחזיק הכיסויים במדיום תבנית נוסף. ואז לסגור את המחזיק עם מכסה זכוכית.
כאשר התאים מוכנים, להוסיף 5 פעמים 10 כדי 5 של תאי אפיתל פיגמנט מונצח מונצחים transffected לתאי אפיתל כדי coverslips ו דגירה התאים במחזיק במשך 10 דקות באינקובטור תרבות התא. בסוף הדגירה, השתמש פיפטה אחת כדי לשאוף את המדיום הישן תוך שימוש פיפטה שנייה לשטוף את התאים חמש פעמים עם מדיום טרי לכל לשטוף כדי להסיר את התאים שאינם מחוברים וכל סרום חזיר עוברי שיורית. לאחר הכביסה האחרונה, להחזיר את המחזיק לאנקובטור במשך שלוש שעות כדי לאפשר התפשטות תא מלא.
כדי לדמיין אירועי אקסוציטוזיס, מקם את מחזיק הכיסוי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת, וחפש תא המבטא VAMP7-pHluorin המתפשט במלואו. לשנות את הזווית של הלייזר עד זווית פלואורסצנטיות השתקפות פנימית הכוללת המאפשרת הדמיה של VAMP7-pHluorin אקסוציטוזיס אירועים הוא הגיע ולבצע רכישה של חמש דקות בתדר התואם את קצב exocytosis ואת ציר הזמן. כדי להשיג את קואורדינטות אקסוציטוזיס, לפתוח את הסרט אירוע אקסוציטוזיס שנרכש בפיג'י ולזהות באופן ידני את אירועי אקסוציטוזיס על ידי הופעת אות בהיר המתפשט החוצה.
השתמש בכלי הנקודה כדי לסמן את מרכז אירוע האקסוציטוזיס ולהשתמש לנתח ולמדוד כדי למדוד את x ו y-קואורדינטות, כמו גם את קואורדינטת הזמן. שמור את המידות של תא אחד בקובץ טקסט אחד. פתח קובץ טקסט בגיליון אלקטרוני והסר את כל העמודות מלבד הפרוסה x וקואורדינטות y.
לאחר מכן, השתמש בכלי הסגלגל ולמדוד כדי למדוד את המרכז ואת הקוטר כדי לקבל את x ו y-קואורדינטות ואת הקוטר של Feret של כל תא. שמור את המידות של כל התאים בקובץ טקסט אחד. פתח את קובץ הטקסט בגיליון אלקטרוני והסר את כל העמודות בקואורדינטות x ו- y וקוטר של Feret.
לאחר מכן הוסיפו את מדידת הרדיוס עבור כל תא, ולאחר מכן השגו את הרדיוס מקוטר הפראט עבור כל תא. השתמש בכלי הקו הישר כדי למדוד את עובי טבעת המיקרופטרן של כל תא. שמור מדידה זו עבור כל התאים בקובץ טקסט אחד ולאחר מכן חלק את אורך ההיתוך ברדיוס התא כדי לחשב את אורך ההיתוך המנורמל.
לניתוח מרחבי של תא יחיד, התקן תחילה את החבילה של RStudio וטען את החבילה ב- RStudio. הפעל את החבילה באמצעות הפונקציה ESA. ממשק משתמש ייפתח ולאחר מכן בחר את הספריה עבור קבצי ערכת הנתונים TXT ומדריך נתונים עבור התוויות הפלט.
הסקריפט יתחיל ויבצע באופן אוטומטי את הניתוח, ויספק קובצי PDF של החלקות המתאימות וקבצי TXT המכילים את התוצאות המספריות. בתוך התא, הרצפה בבדיקה הוא מרווה על ידי ה- pH הנמוך של lysosome, אבל במהלך אקסוציטוזיס, pHluorin מתחיל לפלוט אות כמו pH עולה עקב שחרור פרוטון. אות pHluorin מפגין שיא במהלך אקסוציטוזיס המייצג את השחרור המהיר של פרוטונים ליזוזומליים, ואחריו ריקבון אות אקספוננציאלי המייצג את הדיפוזיה הדו-מימדית של הגשוש בממברנה של הפלזמה.
בדרך כלל, תאי אפיתל מונצחים מונצחים של רשתית אנושית מדגימים פעילות הפרשת ליזומלית חשובה עם קצב אקסוציטוזיס ממוצע של 0.28 הרץ. ניתן לדמיין את ההתפלגות הדו-מימדית של אקסוציטוזיס על ידי הערכת צפיפות הקרנל כדי לחשוף הבדלים בצפיפות המקומית. קיימות שלוש סטיות אפשריות מ אקראיות מרחבית מוחלטת: קיבוץ באשכולות, פיזור או תערובת של קיבוץ באשכולות ופיזור.
ניתן להשתמש בפונקציית K של ריפלי כדי להעריך את הסטיות האלה. שימו לב, אירועי אקסוציטוזיס באזור שאינו דבק מקובצים גם הם ומצביעים על כך שמולקולות הידבקות אינן המבנים היחידים המניעים נקודות חמות הפרשתיות בממברנות פלזמה. התוויית ההיסטוגרמה של אירועי אקסוציטוזיס על פי המודולוס לתא מייצג מגלה שיא סביב הגבול בין האזורים הדביקים ולא דבקים.
ניתוח מזווג מראה כי צפיפות פני השטח נמוכה יותר באזור ההיצמדות מאשר באזור שאינו הידבקות, פוטנציאל בשל ירידה חזקה של אקסוציטוזיס בפריפריה התא. שילוב הידבקות תאים במיקרופטרנים עם ניתוח סטטיסטי מקל על היכולת לאתר במדויק עד כמה תהליכים תאיים מורכבים כגון הפרשה מוסדרים בחלל. דרושה עבודה עתידית נוספת כדי לקבוע איזה מנגנון מולקולרי עומד בבסיס קיבוץ האשכולות של פעילות הפרשה.
