הקרנת חלקיקים הנישאים באוויר בנוגע לציטוטוקסיות ריאתי חריפה על ידי חשיפת תאי ריאות אנושיים מעובדים ב- ALI באמצעות מערכת חשיפה זו במבחנה יכולה לעזור להפחית ניסויים בבעלי חיים. היתרון העיקרי של מערכת חשיפה זו הוא מושג התפלגות אירוסול רדיאלי המוביל להתפלגות הומוגנית ואת המיקום של החלקיקים על התאים. לפני זריעת התאים, להוסיף 2.5 מיליליטר של בינוני צמיחה מחוסמת לכל באר של צלחת שש היטב.
מקם את תרבות התא מוסיף ללא תאים בזהירות בתוך הבארות ולהוסיף מיליליטר אחד של צמיחה בינוני לכל תרבות התא להוסיף. דוגרים את הצלחות במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר טריפסיניזציה של תאים, לדלל 100 microliters של ההשעיה תרבות התא ב מלא 10 מיליליטר של פתרון איזוטוני.
להטות את ה לאט בלי לרעוד. ב מונה תאים, קבע את מספר התאים הקיימים למיליליטר ואת הכדאיות לתא בהתבסס על פרמטרי המדידה הספציפיים לתא של תאי A549. לאחר טמפרמנט של הצלחת, שאפו את המדיום בתוך תרבות התאים וזרעו מיליליטר אחד של תאי A549 עם צפיפות של שלוש כפול 10 לתאים החמישיים למיליליטר בכל תוסף תרבות תאים.
להפיץ את ההשעיה התא על ידי נדנדה עדינה דגירה במשך 24 שעות. הגדר את זמן הלחיצה באמצעות בקרת הזמן בצד הקדמי של העיתונות. פתח את אספקת האוויר הדחוסה בשסתום האוויר הדחוס.
באמצעות ווסת הלחץ בצד הקדמי של העיתונות, הגדר את לחץ האוויר הדחוס לשני ברים בקירוב. משוך את המגירה, לחץ על לחצן לחץ וקרא את הלחץ הקשה על מתג הלחץ הדיגיטלי. ממלאים את מיכל החומר בכמות קטנה של חומר הבדיקה.
הכנס את הבוכנה לתוך מיכל החומר ולהפוך אותו מעט קדימה ואחורה כדי להפיץ באופן שווה את האבקה במיכל. מניחים את מיכל החומר, עם הבוכנה, במגירה וללחוץ על כפתור הלחיצה. פתח את המגירה והסר את הבוכנה.
צעד קריטי הוא לחיצה על חומרי בדיקה שיש לדחוס במיוחד לעוגת אבקה בתוך מיכל החומר על מנת לאפשר חשיפות חלקיקים יציבות. הסר את מתאם ההתרסה ואת רפלקטור ההתמדה מהמודול המנחה של תרסיס. סגור את שלושת נשאי האכלת אירוסול במודול המנחה אירוסול עם תקעים וחיבורי אספקה בינוניים במודול הדגימה עם מדפים דמה.
חבר את קווי הוואקום עם מחבר הצינור של המודול המנחה של תרסיס. השתמש בגלגל היד כדי לסגור את המודול ולמדוד את הערך של בקרי הזרימה. כמה דקות לאחר הסגירה, הערכים יורדים מתחת לחמישה מיליליטר לדקה.
הפעל את תוכנת מחולל אירוסול. אם מגרד החומרים אינו במיקום הנמוך ביותר, לחץ על לחצן מצב ביות. מניחים את מיכל החומר עם חומר הבדיקה לחוץ במהופך על מגרד החומר.
ודא כי הזכוכית של מיכל החומר פונה לחזית. מניחים את לוחית הנעילה בחריץ מעל מיכל החומר ומהדקים את הבורג השחור. שנה את הערכים עבור הזנה וסיבוב להגדרות הרצויות.
השתמש בחצים כלפי מטה כדי לדחוף את השקופית עם מיכל החומר עד מגרד החומר הוא ליד החומר לחוץ. פתח את אספקת האוויר הדחוסה לגנרטור אירוסול עם ברז של בקר הזרימה ההמוני ולהתחיל את הדור אירוסול על ידי לחיצה על כפתור התחל. הגדר את קצב ההזנה ל- 15 עד 20 מילימטרים לשעה כדי למנוע זמני המתנה ארוכים.
שלוט בדור החלקיקים הנכון על ידי התבוננות בענן האבק המשובח עם פנס קטן ממוקם מלמטה מאחורי צינור הזכוכית של האלוטריאטור. התחל את האספקה הבינונית עם מדיום חשיפה שחומם מראש ומלא את מודולי הדגימה עד שהמורדים יכסו בזמן שהמודול פתוח. הכנס תריס תאים עיוורים מוכנס לתוך מודול החשיפה, לשאוב את מדיום החשיפה למטה עד downpipes מכוסים בינוני ואת הצד התחתון של המוסיף נמצאים במגע עם בינוני.
הפעל את מחולל אירוסול, לסגור את מודול החשיפה, ולחבר את מודול החשיפה לשקע מודול החשיפה של מחולל אירוסול. 30 דקות לאחר זמן ההובלה, לאטום את שקע מודול החשיפה של elutriator עם תקע גומי ולהסיר את מוסיף עיוור. מילוי מחדש של מדיום החשיפה עד שהמורדים מכוסים במדיום.
הסר את מוסיף תרבות התא משש צלחות הבאר בעזרת פינצטה. יוצקים את מדיום הצמיחה בזהירות מתרבות התאים מוסיף על ידי הפלת מוסיף ולהשתמש פיפטה כדי לשאפת ולהשליך את הנוזל שיורית. מניחים את המכניסים בתאי החשיפה של מודולי החשיפה ואוויר נקי.
סגור את המודולים והתחל את ניסויי החשיפה על ידי חיבור מודול החשיפה לשקע מודול החשיפה של מחולל התרסיס ומודול האוויר הנקי לאספקת הגז המוביל בו זמנית. לאחר השלמת הניסוי, נתק את מודולי החשיפה ואוויר נקי ואטם את שקע מודול החשיפה. לעצור את אספקת האוויר הדחוסה ואת גנרטור אירוסול על ידי לחיצה על כפתור עצור.
פתח את מודול החשיפה ואוויר נקי ולהשתמש פינצטה להעביר את תרבות התא מוסיף את מוכן לאחר הדגירה שש צלחות היטב. הדגירה שש צלחות היטב, כמו גם את תרבות התאים שלא נוספה מוסיף, במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני בממשק נוזלי האוויר. 24 שעות לאחר החשיפה, הכנס את תרבות התאים מוסיף שש צלחות באר מוכנות חדשות.
הוסף מיליליטר אחד של פתרון WST1 שהוכן טרי לכל הוספת תרבות תא. רוק הצלחות בזהירות על מנת להפיץ את הפתרון הומוגנית על התאים. הדגירה שש צלחות באר עם תרבות התא מוסיף במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
לאחר מכן, להעביר 100 microliters של supernatant ב triplicates מכל שישה צלחת גם לצלחת 96 גם. באמצעות קורא מיקרופלסטיק, למדוד את הספיגה ב 450 ננומטר עם אורך גל התייחסות של 650 ננומטר. ה- CULTEX RFS היא מערכת מודולרית מיוחדת לחשיפה במבחנה המאפשרת חשיפה ישירה והומוגנית של תאים לחלקיקים הנישאים באוויר בממשק נוזלי האוויר.
חשיפה של תאים לאוויר נקי לא מובילה לירידה בכדאיות התא לאורך זמן. מערכת החשיפה אומתה בהצלחה והוותנה כמודל חיזוי למפגעי שאיפה חריפים של התרכובות שנבדקו. חשיפה של תאי A549 לחומרי בדיקה שונים שלא הציגו רעילות, בינונית או חזקה.
אנא ודא שאתה מקפיד לשמור על מסגרות הזמן שהם זמני הדגירה, זמן ההובלה של ייצור חלקיקים, ואת זמני התצהיר חלקיקים. שיטת חשיפה זו מיועדת בעיקר לחשיפת חלקיקים של תאים, אך ניתן להאריך אותה לחשיפה של אירוסולים וגזים נוזליים על ידי התאמת שיטת ייצור התרסיסים. שיטת סינון זו מאפשרת הערכה איכותית של חלקיקים נדיפים לגבי רעילות שאיפה חריפה במבחנה, ובכך להפחית את הניסויים בבעלי חיים שבדרך כלל יספקו הערכה טוקסיקולוגית זו.
אל תשכח כי עבודה עם חומרי בדיקה רעילים יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות, כגון לבישת כפפות, מסכה, תמיד צריך להילקח בעת טיפול תרכובות כאלה.
