הפרוטוקול מספק שיטת תרבות תאים ראשית קלה לטיפול ותואמת באופן נרחב עבור חסרי חוליות ימיים. טכניקה זו נותנת לחוקרים דרך לתרבת את התאים חסרי החוליות הימיים במשך זמן רב יחסית. תרבות של תאים צריכה להיות מסופקת עם רקע גנטי עקבי עבור יישומים ניסיוניים ביולוגיים נוספים שונים במחקר ביולוגיה ימית.
למחקר החדש בתחום זה, אנו מאמינים כי הפרוטוקול המפושט המצוין צריך להיות הבחירה הטובה לממש. לאחר הרדמה, לנתח ולאסוף את המעיים הפנימיים, ולאחר מכן לפצל את דגימות הרקמה אנכית ולהסיר את התוכן הפנימי. לשטוף את דגימות הרקמה PBS פעמיים לחטא אותם על ידי טבילה בתתבון 75%אתנול במשך לא יותר משתי שניות.
ואז לשטוף את דגימות הרקמה PBS שלוש פעמים כדי להסיר את האתנול, ולהעביר כ 100 מיליגרם של דגימת רקמה לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי שני מיליליטר. מוסיפים 1.5 מיליליטר של מדיום תרבות ממוטב מראש לגוש רקמת המעי של מלפפון הים וטחון את הבלוק במספריים כירורגיים מעוקרים עד שהפתרון מעונן. הוסף 400 מיקרוליטרים של 0.25%טריפסין.
מערבבים את הפתרון על ידי היפוך ו דגירה אותו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לסנן את הפתרון באמצעות מסננת תא 100 מיקרון ולאסוף את הסינון בצינור צנטריפוגה מיקרו סטרילי חדש שני מיליליטר. עבור פרוטוקול אופציונלי פשוט, בלוקים רקמות לחתוך במדיה מתורבתת ניתן להעביר ישירות לתוך כלים ולאחר מכן דגירה.
צנטריפוגה הצינור ב 1700xG במשך שלוש דקות, להשליך את supernatant, ולאחר מכן להשעות מחדש את גלולה במדיום תרבות עם אנטיביוטיקה, ולשטוף אותו עם מדיום תרבות פעמיים. הגדר מראש את החממה לתרבות התאים, והפעל אותה מראש לפחות 24 שעות עם טמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס ולחות רוויה. לאחר מכן להשעות מחדש את התאים באמצעות 200 microliters של בינוני המצוין, ולהעביר אותם לתוך מנות ארבעה סנטימטרים.
תרבו את התאים באינקובטור. לאחר שש שעות, מוציאים אותם מהאינקובטור ומוסיפים שני מיליליטר של מדיום מצוין לתא. כל 12 שעות, תחליף חצי מהמדיום.
לאחר חמישה עד שבעה ימים, התאים מתחילים להתחלק. להפחית את ההשפעות השליליות של אנטיביוטיקה על ידי הפחתת הריכוז של אנטיביוטיקה המצוין, פניצילין, סטרפטומיצין, ג'נטמיצין באמצעי התרבות על ידי חצי. כל יומיים עד שלושה ימים, החלף את מדיום תרבות התא.
כאשר צפיפות התאים הראשית מגיעה ל- 60%- ביצוע מעבר תאים. ראשית, לשטוף את התאים התרבותיים פעמיים באמצעות PBS בטמפרטורת החדר. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של תווי טריפסין של 0.25% לכל מנה, והתסיסו ידנית את הכלים, והבטיחו שכל התחתית מכוסה.
השלך את תווי הטרפסין, והדרגר את התאים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של מדיום תרבות טרי על ידי צינורות מחדש השעיית התאים. מעבירים 0.5 מיליליטר של השעיית תאים לצלחת חדשה.
מוסיפים 1.5 מיליליטר של מדיום טרי, ומדגירה את התאים ב 18 מעלות צלזיוס. לאחר 12 שעות, לשנות את המדיום, ולצפות בתאים תחת מיקרוסקופ כדי להעריך את התנאים. הכינו שלוש קבוצות ניסוי, כולל בקרה, ושתי קבוצות פתרונות, עם מיקרומולר אחד ו-100 מיקרומולרים דקסימטזון.
לאחר הדגירה עם או בלי deximethazone עבור אפס, 24, או 48 שעות, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. לאחר כיבוי האור, הוסיפו 300 מיקרוליטרים של תוסף hoechst 33258 ל-12 בארות, והתסיסו בעדינות את הצלחת כדי לכסות את כל התאים, ולהבטיח את הכתמים שלהם. דגירה ב 18 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
לאחר מכן להסיר את פתרון הכתמים hoechst ולתקן את התאים על ידי הוספת 300 microliters של פתרון ארבעה אחוז paraformaldehyde ב PBS לכל באר. מתסיסים בעדינות במשך 15 דקות. לאחר מכן, לשטוף את התאים הקבועים שלוש פעמים PBS.
שמור על PBS לאחר הכביסה האחרונה כדי לשמור על התאים מכוסים. הפעל את חומרת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי, כולל כוח מנורת הכספית, כוח האור הפלואורסצנטי והמחשב. היכנס לחשבון מערכת ההפעלה, הפעל את התוכנה ובדוק את התצורה שלה. מניחים את הצלחת המוכנה על במת המיקרוסקופ.
מקם את הדגימה מעל העדשה האובייקטיבית באמצעות בקר הבמה. מצא את התאים המעניינים תחת מיקרוסקופ האור. עברו למיקרוסקופיה פלואורסצנטיה והתאימו את הפרמטרים של העירור וההפצלה לכ-352 ו-461 ננומטר, בהתאמה, לתצפית גרעיני דנ"א.
ללכוד את התמונות. במחקר זה, תרבות תאי המעי העיקרי של מלפפון ים הוקמה והתפתה. תאים עגולים בשלבים שונים של culturing מוצגים כאן.
הנה תאים המחוברים לתחתית הכלים ביום השלישי, לאחר שנזרעו. הנה התפשטות תאים ביום השביעי. להלן תאים המחוברים לתחתית הכלים לאחר המעבר.
ותאים שאיבדו פעילות וגססו אחרי 10 מעברים. EDU המציינת כי הראיה מספקת ראיות ישירות כדי לחשוף את הפעילות השגשוג של תאים עגולים אלה בשלבים מאוחרים יותר. הגירוי עם דקסימטזון מיקרומולרי אחד הגדיל את קצב התאים האפטוטיים במהירות הרבה ביותר, בהשוואה לבקרה ולגירוי 100 המיקרומולרים deximethazone.
התאים המתורבתים טופלו עם deximethazone לפרקי זמן שונים, ואחריו hoechst 33258 כתמים לגילוי תאים אפטוטיים. טיפולים בתאים לפני הדגירה הם קריטיים לבקרה ארוכת טווח. זוהי תזכורת לנסות את הפרוטוקול האופציונלי המפושט כאשר התא אינו גדל היטב.
Paraformaldehyde רעיל בינוני על ידי מגע בעור או שאיפה, והוא מתועד כמסרטן אנושי כנראה.
