הקמת פרוטוקולי transfection עבור מינים Eimeria יעזור לקדם את המחקר של תפקודי גנים, פיתוח חיסונים חדשניים, וסינון מטרות תרופות חדשות עבור Eimeria. באמצעות טכניקה זו, השגנו את החיתוך של מספר מינים של Eimeria, ו nucleofection הוא כלי שימושי כדי להקל על היישום של מניפולציה גנטית טפילים eimerian. הגרעין של Eimeria מספק התייחסות transfection של טפילים אחרים כי לא ניתן לתרבת במבחנה יהיה להאיץ את המחקר של המניפולציה הגנטית שלהם.
אם אתה מנסה טכניקה זו בפעם הראשונה, אתה צריך להכין היטב את כל reagents ואת המכשירים שלהם לפני תחילת transfection כדי למנוע לטרוף במהלך הניסוי. מימוש שיטה זו מסייע לאנשים המתמקדים בהתמרה של אמריה לראות את הפרטים המורכבים של ניסוי זה. כדי להתחיל עם שחרורו של sporocysts, צנטריפוגה אחת פעמים 10 כדי שבעה oocysts sporulated בתספורת אשלגן dichromate ב 2, 300 פעמים גרם במשך חמש דקות.
לשטוף אותם עם PBS שלוש פעמים. תן את גלולה עם מיליליטר אחד של PBS, ולהעביר את התערובת לצינור 15 מיליליטר. הוסיפו נפח שווה של גם חמוזי זכוכית בקוטר מילימטר אחד, והתנודדו במתלים הוציסטים באמצעות מערבל מערבולת לשחרור האפורוציסטים.
בכל דקה, לפקח על שחרורו של sporocysts על ידי מיקרוסקופיה. כאשר יותר מ-90% מהבעיות שבורות, הפסיקו למערבולת. העבר את ההשעיה sporocyst לצינורות חדשים 1.5 מיליליטר, וצנטריפוגה ב 1, 600 פעמים g במשך חמש דקות.
יש למגר את המשקעים במיליליטר אחד של 50% צפיפות, ובצנטריפוגה ב-10,000 פעמים לדקה אחת. כדי לשחרר ספורוזויטים, יש להשתמש מחדש במשקעים עם חיץ אקססיישן, ולטגר באמבט מים של 42 מעלות צלזיוס למשך 40 עד 60 דקות כדי לשחרר את האפורוזואיטים. לנער את הצינורות פעם בחמש דקות במהלך excystation.
כאשר יותר מ-90% מהספורוזואיטים משתחררים, הפסיקו להידגר. צנטריפוגה ב 600 פעמים g במשך 10 דקות. יש למגר מחדש את המשקעים עם מיליליטר אחד של 55% צפיפות תוסף הדרגתי, וצנטריפוגה הצינור ב 10, 000 פעמים גרם לדקה אחת.
תן מחדש את המשקעים עם מיליליטר אחד של PBS, וספור את הספירוזואיטים באמצעות המוציטומטר. כדי לאסוף את המזוזואיטים מהדור השני של Eimeria necatrix, חותכים את מעי העוף לאורך הגבעול החלמון אל פתח איליוכסל, ולשטוף אותו עם PBS או HBSS בעדינות שלוש פעמים בצלחת פטרי. חותכים את המעי לחתיכות, ומ מניחים אותם בבקבוק חרוט עם חיץ עיכול.
מניחים את הבקבוק על מערבל מגנטי ב 37 מעלות צלזיוס עם בר ערבוב במשך 30 עד 60 דקות כדי לשחרר merozoites. לאחר 30 דקות של דגירה, לפקח על שחרורו של merozoites על ידי בדיקה מיקרוסקופית כל חמש דקות. כדי לטהר את merozoites, יוצקים את ההשעיה המכילה merozoites מתעכל על ארבע שכבות של גזה כדי לסנן לתוך צינורות 50 מיליליטר, צנטריפוגה הצינורות ב 600 פעמים גרם במשך 10 דקות.
לאחר צנטריפוגה, להשליך את העל טבעי המכיל פסולת המעי. מעבירים את המשקעים עם מזוזואיטים מטוהרים לצינורות 1.5 מיליליטר. לתפור מחדש את המשקעים עם מיליליטר אחד של PBS, ולספירת merozoites באמצעות המוציטמטר.
ראשית, צנטריפוגה ההשעיה ספורוזויט או merozoite ב 600 פעמים g במשך 10 דקות. ואז להשליך את העל-טבעי. בסדר הבא, להוסיף 85 microliters של מאגר transfection גרעיני, 10 מיקרוגרם של פלסמיד, ו 25 יחידות של אנזים הגבלה לתוך הצינור 1.5 מיליליטר המכיל ספורוזויטים או merozoites.
מעבירים את ההשעיה לתפנית גרעינית. שים את ה לתוך חריץ העברה גרעינית. הפעל את התקן הגרעין באמצעות לחצן ההפעלה ובחר את הליך ההמרה U-033.
כאשר התוכנית מסתיימת, לחץ על לחצן X של התקן הגרעין והמסך מציג אישור, המציין שהגרעין הצליח. הוסף 0.5 למיליליטר אחד של מדיום הנשר שונה של Dulbecco לגביע הגרעין כדי לעצור את התגובה. לאחר ערבוב עדין, מעבירים את ההשעיה לצינור 1.5 מיליליטר.
לחסן את הטפילים הגרעינים לתרנגולות בן שבעה ימים. לחסן את merozoites של Eimeria necatrix או את sporozoites של אמריה טנלה דרך המסלול cloacal, אבל לחסן אמריה acervulina sporozoites באמצעות הזרקה תוך וררית. לאחר איסוף oocysts מצואה, להשתמש במיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצין ו 150 מיליגרם לקילוגרם pyrimethamine כדי להגדיל את יחס האוכלוסייה מהודק.
פרוטוקול זה שימש כדי לשנות טפילי eimerian. במחקר זה מוצגים כאן מירוטים ומרוזואיטים מהדור השני של אימריה נקטריקס, כמו גם את האפורוציסטים והספורוזואיטים של אמריה טנלה לאחר שימוש בפתרונות שיפוע הצפיפות. התמונות של oocysts של Eimeria necatrix לאחר להדביק עם merozoites nucleofected ואת oocysts של אמריה טנלה לאחר להדביק עם sporozoites גרעין המוזהב מצביעים על גרעין מוצלח.
הדבר החשוב ביותר בעת ניסיון הליך זה הוא לוודא טיהור של sporozoites ו merozoites הם מוצלחים להשתמש בתספור שיפוע 50%density כדי להסיר את OS2 תוך כדי לוודא sporocysts ואת sporozoites מטוהרים יותר. בעקבות הליך זה, אתה יכול לייעל את הפרוטוקול הזה, כגון שינוי oocyst או sporocyst כדי לפשט את הליכי transfection של טפילי Eimeria בעתיד. עם התפתחות transfection באיימריה, טכנולוגיית CRISPR-Cas9 באיימריה צפויה לקדם באופן משמעותי את המניפולציה הגנטית הזהירה של Eimeria ולהחיל אותה ככלי משלוח חיסון מתאים.
