זהו פרוטוקול לבידוד של תאי גזע שריר העכבר הראשי לחקר חילוף החומרים ex vivo. פרוטוקול זה מספק אוכלוסייה הרבה יותר גדולה של תאי גזע בהשוואה לפרוטוקולים אחרים שניסינו בעבר. וחשוב מכך, ברגע שאנחנו מבדילים את תאי הגזע האלה לתוך מיוטובים, הם מפגינים פיזיולוגיה נורמלית, כך שדברים כמו מקצבים ביולוגיים.
כאשר מנסים הליך זה בפעם הראשונה, לרשום הערות מפורטות ולשמור כמה תמונות כי כל רקמה explant נראה שונה ויהיה וריאציה בהיכל של myoblasts. ללא הדגמה חזותית, קשה לדעת אם אתה מבודד את התאים הנכונים. נהנינו מהעזרה הנדיבה של אחרים שהראו לנו שיטה זו כאשר הקמנו אותה במעבדה שלנו.
לאחר הכנת המנה לניתוח על פי כתב היד, הכינו תא לח על ידי הנחת שניים עד שלושה גיליונות נייר סופג עבה לתוך שקית ניילון ולהשתמש פיפטה להרטיב את פני השטח של הנייר עם מים סטריליים. מניחים את התא תחת אור UV במשך חמש דקות כדי לעקר. לנתח את השריר הרצוי מעכבר בן ארבעה עד שמונה שבועות ולשטוף בעדינות PBS המכיל 40 מיקרוגרם למיליליטר ג'נטמיצין כדי לעקר.
השתמש ממטרים סטריליים כדי להעביר את השריר לצלחת פטרי סטרילית 10 ס"מ לא מצופה. מוסיפים 0.5 למיליליטר של ציפוי התקשורת על השריר כך הרקמה לחה אך לא צפה. השתמש אזמל סטרילי או סכין גילוח כדי לחתוך בעדינות את השריר לרסיסים קטנים.
השתמש ממטרים או פיפטה כדי להעביר את שברי השריר על פני השטח של צלחת מצופה מראש שישה סנטימטרים. בעדינות רבה כיסוי נוסף 0.8 מיליליטר של ציפוי התקשורת על הרקמה. מניחים את צלחת ששת הסנטימטר המכילה את שברי השריר בתוך התא לח ולהחזיר אותו אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 48 שעות.
הכינו וקדם מיובלסט מדיה, טריפסין ו PBS-gentamycin באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לצפות בקבוק T25 עבור כל קבוצת שרירים, להוסיף שני מיליליטר של פתרון ציפוי על פני השטח של הבקבוק, לנער בעדינות כדי ליצור מעיל אחיד על פני השטח, ו דגירה הבקבוק בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. עכשיו עם פיפטה, להסיר את התקשורת ציפוי מן השריר explants בעדינות לשטוף את השריר explants עם שני מיליליטר של PBS-gentamycin.
הסר במהירות את PBS ואל תיתן לצלחת לשבת ב- PBS. לאחר מכן מוסיפים בעדינות מיליליטר אחד של PBS-gentamycin ומ מניחים את הצלחת באינקובטור 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. השתמש P1000 פיפטה כדי לאסוף את PBS עם תאים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.
לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של טריפסין לצלחת ומחזירים אותו לאנקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. הקישו בעדינות על הצלחות כדי לנתק את המילובסטים. לאסוף את טריפסין עם תאים ולשלב עם אוסף PBS.
הוסף שמונה מיליליטר של מדיה myoblast לצינור צנטריפוגה בעדינות להפוך לערבב. בעדינות כיסוי שני מיליליטר של פתרון ציפוי על צלחות השריר ולהחזיר את הצלחות אינקובטור 37 מעלות צלזיוס. סובב את צינורות הצנטריפוגה המכילים תאים בצנטריפוגה במשך שלוש דקות ב 200 פעמים g.
שאף את העל-טבעי ושמור כמיליליטר בצינור. מוסיפים בעדינות את המדיה myoblast, מעבירים את התאים לבקבוק מצופה מראש ומ מניחים את הבקבוק באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. שאפו את התקשורת מבקבוקי T25 מיובלסט P0.
לשטוף את התאים לזמן קצר עם שני מיליליטר של PBS חם-gentamycin ואז לספירה PBS מן הבקבוק. פיפטה שני מיליליטר של PBS חם לתוך כל בקבוק המכיל מיובלאסטים. מניחים את הבקבוקים עם PBS לתוך החממה 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות.
לאחר מכן הקישו בחוזקה על צד הבקבוק כדי לנתק את התאים. בדוק תחת מיקרוסקופ אור עבור myoblasts צף בחופשיות. מניחים את flasks זקוף מכסה המנוע של תרבות הרקמה ולשטוף את החלק התחתון של flasks עם 10 מיליליטר של מדיה myoblast פעמיים עד שלוש פעמים כדי להבטיח את כל התאים הם נקע.
לאסוף את תערובת מדיה התא בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. צנטריפוגה במשך שלוש דקות ב 200 פעמים g. שאף את התקשורת להשאיר סביב מיליליטר אחד בצינור נזהר כדי למנוע את גלולת התא.
הוסיפו בעדינות נפח מתאים של מדיה myoblast לצינור הצנטריפוגה ומערבבים בעדינות. מפיצים את תערובת התאים לבקבוקי T75 חדשים שישה מיליליטר כל אחד. הוסף 10 מיליליטר של מדיה myoblast לכל בקבוק T75 חדש.
בעדינות לנער את flasks אופקית כדי להפיץ את התאים למקם אותם באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס לילה. בפרוטוקול זה, תאים ראשוניים הגיחו מן המתפוצצים נצפו תחת מיקרוסקופ אור סטנדרטי. יבולים מוקדמים של מיובלאס הופיעו כעולמות עגולים ובהירים קטנים.
ההידול של myoblasts לקח ארבעה עד שישה ימים שבמהלכם המורפולוגיה של התאים השתנה מעולמות עגולים בודדים סיבים מוארכים התמזגו ארוך רב גרעינים. מיוטובים מובחנים לחלוטין הניבו שהיו מוכנים למדידת שיעורי צריכת החמצן. תאים אלה יכולים לשמש עבור מספר יישומים במורד הזרם.
לדוגמה, לעתים קרובות אנו משתמשים בהם כדי ללמוד שטף מצעים במכשירי סוסון ים.
