השיטה הפשוטה והזולה שאנו מכנים MDR מאפשרת לך לבודד אוכלוסיות מועשרות של זרע פצ'יטן, זרעונים עגולים וזרעים מאריכים ממבחן העכבר. היתרון העיקרי של שיטת MDR הוא הפשטות שלה. אתה צריך רק ציוד מעבדה סטנדרטי הזמינים ברוב מעבדות המחקר הביו-רפואי.
פרוטוקול MDR הוא נהדר עבור חוקרים עושים מחקרים פונקציונליים על תאים נבט זכר. לדוגמה, קבוצות הלומדות זרע, גורמים המשפיעים על פוריות הגבר, כמו גם ירושה אפיגנטית אבהית. חומר התחלתי מינימלי נדרש עבור שיטת MDR.
ולמעשה, אנו משיגים באופן שגרתי כמות טובה של תאים באמצעות עכבר זכר בוגר אחד בלבד. התחל בהגדרת הציוד והריגנס הדרושים. הגדר אמבט מים ל 37 מעלות צלזיוס וחממת תרבות תאים 34 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו 95% לחות.
מניחים מסובב צינור בתוך החממה. הכינו ותייגו את הכמות המתאימה של מגלשות זכוכית מיקרוסקופיות, ולאחר מכן ציירו טבעת בקוטר של כ-1 ס"מ עם עט גריז, ותנו לשמן להתייבש. כאשר מוכן לנתח את החיה, לרסס את הבטן הגחונית של העכבר עם 70% אתנול ולהשתמש מספריים כדי להפוך את פתיחת צורת V בחלל האגן הבטן.
משוך על כרית השומן epididymal עם מלקדס, לאתר את האשכים ולהסיר אותם עם מספריים, הקפד להימנע להפריע אלביניה טוניקה. מניחים את האשכים על צלחת פטרי באורך שישה סנטימטרים המכילה 1X KREBS. ערפו את האשכים והשליכו את אלביניה הטוניקה, ואז פיזרו מעט את הצינורות החצי-חצי-שנתיים על-ידי כך שהם מקניטים אותם בעדינות במפולות.
מעבירים אותם לצינור חרוט 50 מיליליטר המכיל שני מיליליטר של תוסף קולגן טרי. הדגירה את הצינורות באמבט המים 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות, להרגיז אותם בעדינות על ידי נדנדה. לאחר מכן הוסיפו לפחות 40 מיליליטר של KREBS 1X חם ואפשרו לפקעות להצטייד בטמפרטורת החדר.
הסר את העל-טבעי וחזור על השטיפה פעם נוספת. הוסף 25 מיליליטר של פתרון טרי. מניחים את הצינור על המסובב בתוך חממת תרבות התא, ולהשאיר אותו שם במשך 15 עד 20 דקות, מסתובב בערך 15 סל"ד.
תבדקו באופן ספורדי את הצינוריות. לאחר הפתרון הופך מעונן רק חתיכות קטנות של tubules להישאר, מניחים את הצינור על הקרח ולהמשיך לשלב הבא. סנן את הפתרון באמצעות מסננת תאים של 40 מיקרומטר לצינור חרוט חדש של 50 מיליליטר על קרח.
ואז צנטריפוגה זה ב 600 x g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי גלולה את התאים. בזהירות לשפוך את supernatant והקש על גלולת התא כדי לעכל מחדש את התאים בשארית KREBS 1X. הוסף לפחות 40 מיליליטר של KREBS 1X קר לתאים המתווסכים מחדש וחזור על הצנטריפוגה.
תן שימוש חוזר בתאים על ידי הקשה על הצינור. לאחר מכן הרם קצה פיפטה על פיפסה מיליליטר אחד לחתוך אותו כך הצמצם הוא כשלושה מילימטרים בקוטר. הוסף עד שלושה מיליליטר של 0.5%BSA ב KREBS.
תן שימוש חוזר בתאים על ידי צינור למעלה ולמטה, הקפד להימנע בועות. סנן את מתלי התא באמצעות מסננת של 40 מיקרומטר והמשך מיד לטעינת התאים על מעבר הצבע של ה- BSA. עליך להשיג השעיה הומוגנית של תא בודד לפני טעינת התאים אל מעבר הצבע.
תאים מקובצים יהיה מעים מהר יותר, לשבש את ההדרגה שלך לזהם את השברים. הגדר צינור 50 מיליליטר אנכית על קרח, לוודא כי ניתן לראות צד אחד של הצינור. ואז לחתוך על חמישה עד עשרה מילימטרים מהקצה של פיפטה סרולוגית עשרה מיליליטר ולהרים אותו על בקר פיפטה.
פיפטה חמישה מיליליטר של פתרון 5%BSA לתחתית הצינור 50 מיליליטר. גע בעדינות על פני השטח של פתרון 5%עם קצה החתך של הפיפיאט ושכבה איטית חמישה מיליליטר של פתרון 4%BSA על גבי פתרון 5%.. חזור על הליך זה עם פתרונות BSA אחרים כדי להשיג מעבר צבע של 5%-1%BSA.
קו ברור אמור להיות גלוי בין השכבות. לאחר מכן טען בזהירות את ההשעיה של תא יחיד על גבי המילוי ההדרגתי מבלי להפריע לו. תן לתאים להסס דרך ההדרגה במשך שעה וחצי.
באמצעות קצה פיפטה לחתוך, בזהירות לאסוף את שברים מיליליטר אחד לתוך צינורות נפרדים 1.5 מיליליטר ולאחסן אותם על קרח, הקפד למספר את הצינורות בסדר שהם נאספו. צנטריפוגה שברי תא הנבט ב 600 x גרם במשך עשר דקות בארבע מעלות צלזיוס. ואז לדאוג לא להפריע גלולה, להשליך את רוב supernatant ו resuspend התאים על ידי הפלת הצינור.
מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ קר כקרח 1X KREBS לכל צינור וחוזרים על הצנטריפוגה. השליכו את רוב העל-טבעי, השאירו כ-100 מיקרוליטרים והתינו מחדש את גלולת התא בזהירות. כדי לנתח את שברי התאים, התחל בצינורות של 20 מיקרוליטרים של 4%paraformaldehyde בתוך כל טבעת עט גריז בשקופית מיקרוסקופית ממוספרת.
הוסף מיד שני מיקרוליטרים של התאים המתווסכים מהשבר המתאים. ואז לייבש את המגלשות בטמפרטורת החדר לפחות שעה אחת. שטפו את השקופיות פעם אחת באמצעות PBS ולהשתמש במדיום הרכבה עם DAPI כדי לטעון את השקופיות.
נתח כל שקופית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להעריך איזה סוג תא נבט מסוים מועשר בכל שבר. לאחר דגימה מכל שבר נלקח עבור מיקרוסקופיה, להוסיף מיליליטר אחד של קרח קר 1X KREBS לכל שבר צנטריפוגה התאים למטה ב 600 כדי 13000 x g במשך עשר דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר והשליך את העל-טבעי והמשך בניתוח במורד הזרם המועדף.
פרוטוקול זה עובד טוב במיוחד להעשרת זרע עגול. העשרה מעל 90% הושגה בשברים 2, 3 ו-4. זרע התארכות נוטים להישאר על גבי השיפוע נאספו עם השבר הראשון.
בשל גודלם הגדול, זרע pachytene מים מהר יותר נאספו האחרון. ההעשרה עמדה על כ-75% בשברים 14 ו-15. RNA הכולל המתקבל מרוב שברים נע בין 0.5 ל 2.5 מיקרוגרם, מספיק עבור ניתוחי RNA במורד הזרם.
כמות החלבון המתקבלת מכל שבר נעה בדרך כלל בין 20 ל -140 מיקרוגרם, וזה מספיק עבור כמה כתמים מערביים. בפרוטוקול זה, 10% מהליזטים החלבוניים שמקורם בשברים בודדים הספיקו כדי לזהות בבירור חלבוני DDX4, PIWIL1 ו- PIWIL2 על כתם מערבי סטנדרטי. כמות החלבון בשבר אחד הספיקה גם עבור immunoprecipitation באמצעות נוגדן נגד PIWIL1, כמו גם לגילוי של PIWIL2 coimmunoprecipitated.
אפילו עבור שעון ראשון, פרוטוקול זה עובד טוב מאוד כל עוד אתה מוודא כי טרום הטיפול של התאים שלך הוא טוב, ושום דבר לא מפריע שיפוע שלך במהלך המעים. מעכבר יחיד, אתה מקבל תאים מועשרים מאוד, אשר ניתן להשתמש בהם עבור ניתוחים במורד הזרם שונים כגון RT-PCR, ריצוף RNA, immunoprecipitation ורוקנות מערבית. בעוד MDR היא לא השיטה היחידה להעשרת תאים נבט זכר, הוא כלי נוח מאוד כי זה לא דורש שום ציוד מיוחד או הכשרה נרחבת.
