הפרוטוקול שלנו יכול לשמש לייצור שלל חוץ-תאי מועשר אקסוזום באיכות גבוהה מתאי גזע עובריים המבטאים את גורם הגירוי החיסוני, GM-CSF. שלפוחיות חוץ-תאיות מועשרות אקסוזום הנושאות GM-CSF, יש פוטנציאל לשרת שלפוחיות רגולטוריות חיסוניות ללא תאים שיכולות לווסת את התגובה החיסונית. חוקרים עם הכשרה בסיסית ביולוגיה מולקולרית ותאית, צריך להיות מסוגל בקלות כמו פרוטוקול זה, אבל כל מי שמבצע פרוטוקול זה בפעם הראשונה צריך לעקוב אחר ההוראות מקרוב.
מכיוון שהפרוטוקול שלנו מסובך, הדמיית הפרטים המורכבים של כל שלב תעזור לחוקרים אחרים ליצור FBS בחינם exosome, ultracentrifuge את הנפח הרצוי של FBS ולאסוף את supernatant חינם exosome. לפני ציפוי ESD שלושה תאים, מעיל 15 ס"מ תרבית רקמות מנות עם 0.1% ג'לטין בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. הסר ג'לטין על ידי שאיפה ותרביות שלושת התאים ESD ללא תאי שכבה מאכילים ב ESD שלושה תאי תרבית בינוני ב 37 מעלות צלזיוס ב 5%פחמן דו חמצני לח אינקובטור עד התאים להגיע 90% השפעה.
לשטוף את התרבויות כמעט confluent עם חמישה מיליליטר של 0.05% טריפסין למנה ואחריו דגירה של חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס טרי טרי. בסוף הדגירה למשוך את התאים המנותקים בצינור צנטריפוגה ולהפעיל את טריפסין עם חמישה מיליליטר של מדיום תרבות טרי. משקעים את התאים על ידי צנטריפוגה ומשהים מחדש את המשטחים במדיום טרי לספירת מזון, צלחת חמש פעמים 10 עד השישי של ESD שלושה תאים ב 15 מיליליטר של תרבית התא מדיום על לוחות מצופים ג'לטין חדש במשך שלושה ימים של תרבות לפני sub-culturing התאים כדי לאסוף את תרבית התא supernatant לבידוד של לוח שלפוחיות מועשר exosome פעם אחת 10 עד השביעי ESD שלושה תאים ב 15 מיליליטרים של מדיום תרבית התאים לכל צלחת מצופה ג'לטין חדשה במשך שלושה ימים לפני איסוף תרבית התאים עבור בידוד ארסיית תאית מועשר אקסוזום, משקעים ראשונים את שברי התאים הגדולים בתוך supernatants שנאספו 72 שעות ESD שלושה תאים על ידי צנטריפוגה.
לאחר איסוף supernatant, Ultracentrifuge הדגימות ולהשליך את supernatants. יש לשטוף בעדינות כל פלטה פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS לכביסה כדי להסיר כל תרבות שיורית על-טבעית ולכומת את תכולת חלבון ההזרמה החוץ-תאית המועשרת האקסוזום עם בדיקת חומצה בינצ'ונינית, בהתאם להוראת היצרן. לאחר מכן להשעות מחדש את שלל חוץ תאי מועשר exosome ב PBS ב שישה מיקרוגרם לריכוז מיקרומטר לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס.
כדי לדמיין את שלל חוץ-תאי מועשר exosome על ידי מיקרוסקופיה אלקטרונים שידור לתקן שלושה עד חמישה מיקרוגרם למיליליטר של שלל חוץ תאי עם הריכוז הסופי של 2% רשת מיקרוסקופ אלקטרונים paraformaldehyde בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. בסוף הדגירה, לטעון 10 microliters של הדגימות הקבועות על רשתות נחושת עם סרט תמיכה בפחמן במשך דקה אחת לפני ניקוז הרשתות עם נייר מסנן, להישאר ברשתות עם פתרון כתמים מתאים, על פי פרוטוקול היצרן ולהשתמש פינצטה להעביר את הרשתות לפיסת נייר מסנן, ואז להשתמש במיקרוסקופ אלקטרוני השידור עם הגדלה של פי 50, 000 כדי לרכוש תמונות מיקרוסקופיות אלקטרוניות, על פי הפרוטוקולים הסטנדרטיים. כדי להכין תמציות תאים שלמים, לאסוף ESD שלושה תאים מתרבית כפי שהודגם, ולהשעות מחדש את התאים שנקטפו PBS לספירה.
לאחר צנטריפוגה שנייה, להשעות מחדש את התאים מתוך חמש פעמים 10 לתאים השלישיים לכל מיקרוליטר של מאגר טעינת עמוד SDS המכיל ריכוז SDS של 0.5%, ו- Sonicate הדגימות למשך 10 שניות על Sonicator עם משרעת של 10%. ואז לחמם את הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. כדי להכין ליסאטים עבור שלל חוץ תאי מועשר exosome, להשעות מחדש את שלטי exosome מועשר חוץ תאית במאגר טעינת עמוד SDS המכיל 0.5% SDS בריכוז 1.2 מיקרוליטר ו Sonicate הדגימות במשך 10 שניות כפי שהוכח ואז לחמם את הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
לניתוח כתם מערבי, טענו 10 תמצית סיטונאית מיקרוליטרית ודגימות זליטה חוץ-תאיות מועשרות אקסום לתוך בארות בודדות של ג'ל דף מתח מיטבי. בסוף הריצה, להעביר את החלבונים על ממברנות PVDF ולדגירה את הממברנות עם נוגדנים ראשוניים ומשניים מתאימים של עניין, ולאחר מכן לזהות את ביטוי החלבון באמצעות ערכת זיהוי chemiluminescence משופרת, על פי הוראות היצרן. כדי להעריך את כמות GM-CSF בתוך שלפוחיות חוץ-תאיות מועשרות אקסוזום, השתמש בערכה Murine GM-CSF כדי לצפות צלחת ELISA עם נוגדן לכידת אנטי GM-CSF הבא, לטפל 0.6 מיקרוגרם של דגימות שלפוחיות חוץ-תאיות מועשר אקסוזום עם 100 microliters של PBS לבד, או PBS בתוספת 0.05%tween 20 בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
בסוף הדגירה, להוסיף את הדגימות שטופלו לבארות בודדות של צלחת ELISA מוכן עבור דגירה של שעה אחת בטמפרטורת החדר ואחריו שטיפת וולות המתאימות המתאימות עם PBS לבד, או PBS בתוספת 0.05% tween 20. לאחר הכביסה, מוסיפים את נוגדן הזיהוי לדגימות לדגירה של שעה בטמפרטורת החדר ואחריה שטיפה עם PBS לבד או PBS פלוס 0.05%tween 20 כפי שהודגם, ואז מוסיפים את אבידין חזרת Peroxidase לדגימות לדגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו שטיפה ומדידת הספיגה בכל באר על קורא מיקרופלאט ב 450 ננומטר. עוצמת הפלואורסצנטיות של GM-CSF המבטאת קו תאים של ESD שלושה או קו תאים של ESD בעל שלושה המבטא וקטור ריק גבוהה בהרבה מזו של עמיתיהם ההורים.
ELISA מגלה כי ESD שלושה תאים המבטאים GM-CSF לייצר רמות גבוהות משמעותית של GMCSF בתרבית התא שלהם supernatant מאשר לעשות תאי בקרה וקטורית ריקים. יתר על כן, כמות GM-CSF שנוצר על ידי GM-CSF מבטא ESD שלושה תאים דומה לזה המיוצר על ידי פיברובלסטים STO מבטא GM-CSF. מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור של שלל חוץ תאי מבודד מן transduced וקטור ו GM-CSF transduced תרביות תאים transduced לחשוף שלל בגדלים שונים הנופלים בטווח קוטר 30 עד 100 ננומטר הצפוי.
הביטוי של סמנים exosomal, כולל CD81, Annexin V ו flotillin-1 משופר באופן משמעותי בשלפוחיות חוץ תאיות, מבודד ESD שלושה תאים לעומת תמציות סיטונאיות תואמות על ידי ניתוח כתם מערבי. חשוב לציין, נוכחותם של סמני תאים תת-תאיים אחרים ב- ESD שלושה שלל חוץ-תאי נגזר לא זוהה כולל סמן רשתית אנדופלסמית, חלבון דיסולפיד איזומראז, סמנים מיטוכונדריאליים, ציטכרום C ו- Oxphos קומפלקס IV-subunit IV ואת הסמן הציטוטוסולי GAPDH. לאחר הכביסה עם 0.05% tween 20, רמות הרקע GM-CSF שזוהו בשלל חוץ תאי שליטה צומצמו באופן משמעותי.
לעומת זאת, רמות GM-CSF של שלל חוץ תאי של תאים מבטא GM-CSF גדל באופן משמעותי על ידי 10. רכישת שלל חוץ-תאי מועשר באיכות גבוהה הנושאת GMCSF היא הצעד החשוב ביותר להצלחת פרוטוקול זה. חוקרים יכולים לבצע ניסויים נוספים, כגון מחקרים בקווי תאים ובעלי חיים תלויים GM-CSF כדי לקבוע אם שלפוחיות חוץ-תאיות מועשרות אקסוזום אכפתיות GM-CSF יכול לתפקד כשלפוחיות רגולטוריות חיסוניות ללא תאים.
אלה exosome מועשר שלשלות חוץ תאיות אלה יכולים לשמש כדי לחקור כיצד אפנון התגובה החיסונית משפיע על תנאי מחלה שונים.
