分离外体富集的细胞外囊泡携带颗粒细胞-巨噬细胞-胚胎干细胞的细胞外刺激因子

我们的协议可用于从胚胎干细胞中产生高质量的外体浓缩细胞外囊泡，表达免疫刺激因子，GM-CSF。外体富集的细胞外囊携带GM-CSF，有可能提供无细胞免疫调节囊泡，可以调节免疫反应。接受过基本分子和细胞生物学训练的研究人员应该能够像这个协议一样轻松，但是任何第一次执行这个协议的人都应该密切关注这个方向。

由于我们的协议是复杂的，可视化每一步的复杂细节将有助于其他研究人员产生外体免费FBS，超中心融合FBS所需的体积，并收集外体免费超高纳特。在电镀ESD三细胞之前，在室温下用0.1%的明胶涂抹15厘米的组织培养皿30分钟。在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳加湿培养器中，通过吸入和培养 ESD 三个没有支线层细胞的 ESD 三细胞去除明胶，直到细胞达到 90% 的汇流。

用每道菜0.05%的5毫升洗涤几乎汇流的培养物，然后在37摄氏度的新鲜试丁香中孵育5分钟。在孵化结束时，将分离的细胞拉入离心机管中，用五毫升的新鲜培养基灭活试剂。通过离心沉积细胞，并在新鲜介质中重新悬挂托盘，用于计数以进行传递， 板五倍10至第六ESD三细胞在15毫升的细胞培养介质到新的明胶涂层板三天的培养之前，分栽培细胞收集细胞培养超高分子分离外体富集细胞外囊板1倍10至第七ESD三细胞在15每块新的明胶涂层板的细胞培养介质的毫升在收集细胞培养超分子之前三天，为了外体富集额外的细胞囊泡分离，首先通过离心从72小时培养ESD三个细胞的超分子中沉积出大细胞片段。

收集超高分子后，超中心将样品放样并丢弃超纳特。根据制造商的说明，每次洗涤用一毫升PBS轻轻冲洗每片片，去除任何残留培养物超高分子，并用Bicinchonin酸检测量化外体富集的细胞外囊素蛋白质含量。然后以每微米浓度六微克的浓度重新悬挂 PBS 中富含体的细胞外囊，以零下 80 摄氏度储存。

通过传输电子显微镜可视化外体富集的细胞外囊泡，每毫升细胞外囊泡修复三到五微克，最终浓度为 2%电子显微镜网格双酚醛，在室温下为两小时。在孵化结束时，用碳支持膜将固定样品的 10 微升加载到铜网格上一分钟，然后用滤纸排出网格，根据制造商的协议，使用适当的染色溶液留在网格中，并使用钳子将网格转移到一块滤纸上， 然后根据标准协议，使用放大5万倍的传输电子显微镜获取电子显微镜图像。要准备整个细胞提取物，从培养物中收集ESD三个细胞，并重新暂停PBS中收获的细胞进行计数。

第二次离心后，将每个 SDS 页面加载缓冲器的 5 倍 10 到第三个细胞重新悬挂到包含 0.5% SDS 浓度的微升波器中，并将样品在 10% 振幅的声波器上进行 10 秒的声波处理。然后在100摄氏度下加热样品5分钟。为准备外体富集的细胞外囊泡的裂解剂，在 SDS 页面加载缓冲中重新暂停外体浓缩的细胞外囊泡，该缓冲器以每微升浓度 1.2 微克的速度包含 0.5% SDS，并将样品进行 10 秒的声波测量，然后在 100 摄氏度下加热 5 分钟。

对于西 Blot 分析，将 10 微升批发提取物和外体富集的细胞外囊裂解剂样品装载到最佳应力页凝胶的单独井中。在运行结束时，将蛋白质转移到PVDF膜上，并用适当的一级和二级抗体孵育膜，然后根据制造商的说明使用增强的化学发光检测套件检测蛋白质表达。评估外体富集细胞外囊中的GM-CSF量， 使用套件 Murine GM-CSF 涂上 ELISA 板与抗 GM-CSF 捕获抗体，仅用 100 微升 PBS 或 PBS 加 0.05%tween 20 在室温下处理 0.6 微克外体富集细胞外囊泡样品 30 分钟。

在孵化结束时，将经过处理的样品添加到准备好的 ELISA 板的单独井中，在室温下孵育一小时，然后单独用 PBS 或 PBS 加 0.05%tween 20 清洗相应的井。洗涤后，在样品中加入检测抗体，在室温下孵育一小时，然后用PBS或PBS加0.05%tween 20进行洗涤，然后在样品中加入Avidin马萝卜过氧化酶，在室温下孵育30分钟，然后在450纳米的微板读卡器上清洗并测量每口井的吸水量。GM-CSF 表达 ESD 三细胞线或 ESD 三细胞线表示空矢量的 GFP 荧光强度远远高于其父母的荧光强度。

ELISA显示，ESD三个表达GM-CSF的细胞在其细胞培养中产生的GMCSF水平明显高于空载体控制细胞。此外，GM-CSF表达ESD三个细胞产生的GM-CSF量与表达GM-CSF的STO成纤维细胞产生的量相似。从移位载体和GM-CSF转导细胞培养物中分离出的细胞外囊的传输电子显微镜揭示了不同尺寸的囊泡，这些囊泡的直径在预期的30至100纳米范围内。

与西方斑点分析的相应批发提取物相比，细胞外囊泡中外切除标记（包括CD81、附素V和浮石-1）的表达明显增强。重要的是，在ESD中未检测到其他亚细胞间标记物的三个衍生细胞外囊泡，包括内质质标记、蛋白质脱硫异酶、线粒体标记、细胞色素C和Oxphos复合IV-子单元IV和细胞溶性标记GAPDH。洗涤0.05%tween 20后，在控制细胞外囊泡中检测到的背景GM-CSF水平显著降低。

相比之下，GM-CSF表达细胞的细胞外囊中的GM-CSF水平显著提高了20。获得携带 GMCSF 的高品质外体浓缩细胞外囊泡是本协议成功最重要的步骤。研究人员可以进行额外的实验，如研究转基因-CSF依赖细胞系和动物，以确定外体丰富的细胞外囊囊护理GM-CSF是否可以作为无细胞免疫调节囊泡。

然后，这些外体丰富的细胞外囊泡可用于探索免疫反应的调节如何影响不同的疾病条件。