פרוטוקול זה הוא משמעותי כי נוכחות של תאי גזע סרטניים עשוי להיות קשור עם הידרדרות או תוצאה גרועה לאחר הקרנות. לימוד תאי הגזע הרדיו-ססיסטיים עשוי לספק רמזים להתגברות על הרדיו-ארסיסטיות. בטכניקה זו, תאי גזע סרטניים מלוחים עם סמנים putative על ידי cytometry זרימה ואת יכולת התחדשות עצמית של תאים מלוחים מוערך על ידי מוצלח היווצרות כדור.
ההתרשכות היווצרות המושבה מבוצעת כדי להעריך את הרגישות הרדיואקטיבית של תאים מלוחים. הוא קובע כמה תאים איבדו את יכולתם ליצור את הסינתזה שיוצרת את המושבה לאחר מנה מסוימת של קרינה. כתב יד זה מספק את הצעדים הראשונים למחקר רגישות רדיואקטיבית של תאי גזע סרטניים, אשר קובע את הבסיס למחקר מנגנון מלא יותר.
מחקר מנגנון עשוי לכלול חלבונים הקשורים לתיקון נזק DNA, אישור של מיני חמצן תגובתי, מעצר מחזור התא, וכו '. זה יספק תובנות חשובות על איך תאי גזע סרטניים לקבל radioresistance וכיצד להתגבר על ההתנגדות. הדגמת הליך הקרינה תהיה חן-נאן לי, טכנאי קרינה מהמחלקה שלנו.
כדי להתחיל בהליך זה, תאים A549 תרבות RPMI-1640 בינוני בתוספת 10% FBS ב 10 ס"מ מנות ב 37 מעלות צלזיוס, עם 5% פחמן דו חמצני. כאשר התאים מגיעים ל- 80 עד 90%,confluence, הסר את מדיום התרבות. בקצרה לשטוף את התאים עם שלושה מיליליטר של PBS.
לאחר מכן, מוסיפים שלושה מיליליטר של 0.05% טריפסין לכל מנה. הסר את טריפסין ולהשאיר את טריפסין residuary לעכל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 עד 3 דקות. בדוק את הניתוק של התאים לעתים קרובות, כדי למנוע עיכול יתר.
כאשר התאים הופכים רופף ולהתחיל להתנתק מן הכלים, להוסיף שלושה מיליליטר של RPMI-1640 בינוני בתוספת 10% FBS ולהעביר את התאים השעיה לצינור 50 מיליליטר. צנטריפוגה ב 300 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והתן מחדש את התאים ב-10 מיליליטר של PBS.
העבר 0.5 מיליליטר של ההשעיה התא לתוך צינור חדש כבקרת isotype. צנטריפוגה הן את צינורות הבקרה והן את צינורות הניסוי ב 300 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעיים.
לאחר מכן, לדלל הן את בקרת איזוטיפ diconjugated פלואורסצנטי נוגדן PBS לריכוז אופטימלי titrated כדי להכין את פתרון העבודה. יש לעכל מחדש את הבקרה ואת תאי הניסוי עם כל פתרון עבודה ומערבבים בעדינות. הדגירה את הדגימות בחושך ו בטמפרטורת החדר במשך 30 עד 40 דקות.
לשטוף את התאים על ידי הוספת 10 מיליליטר של PBS, ערבוב בעדינות, צנטריפוגה ב 300 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעיים ותיישם מחדש את התאים עם 10 מיליליטר של PBS. לאחר מכן, מניחים 40 מסנני תא מיקרומטר על צינורות חדשים של 50 מיליליטר, ומוודאים להכין צינור נפרד ומערך מסננים עבור הבקרה ותאי הניסוי.
החל כל מתלה תא על מסננת בהתאמה ולאסוף את הזרימה. צנטריפוגה הזרימה ב 300 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים עם 0.2 עד 1.0 מיליליטר של PBS והעבר כל מתלה תא לצינור נפרד של חמישה מיליליטר עבור ציטומטריית זרימה.
בארון בטיחות ביולוגי, הכינו צלחת אחת של שש היטב לכל מנה של קרינה, כולל הקבוצה האפורה אפס. הוסף 1.5 מיליליטר של מדיה שהושלמה 1640 לכל באר. לדלל תאים שנקטפו עם מדיה הושלמה 1640 לצפיפות תאים של 1, 000 תאים למיליליטר.
לאחר מכן, מוסיפים את ההשעיה התא מדולל ל בארות לנער את הצלחות אופקית כדי להפיץ באופן שווה את התאים בארות. הקלט את אמצעי האחסון שנוסף בכל קבוצת מנות. תרבות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
לאחר התאים מחוברים לתחתית בארות, להוסיף הושלמה 1640 מדיה לכל באר עד הגובה התקשורתי מגיע סנטימטר אחד. כאשר הצלחות מועברות בין חדר תרבות התא לחדר הקרנות, לעטוף את הצלחות עם רדיד אלומיניום או לשים אותם בתיבה נקייה, כדי למנוע זיהום. החזק את הצלחות שטוחות כדי למנוע שפיכה בינונית החוצה.
לאחר מכן, נקבע על 20 ס"מ על ידי שדה קרינה 20 ס"מ. מניחים בולוס שווה ערך לרקמה בעובי 1.0 ס"מ על ספת הטיפול וממקמים את צלחת ששת הטובים על הבולוס כדי לשמור אותם במגע. תוודא שכל הלוחית נמצאת בתוך שדה הקרינה.
הגדר את מרחק המקור-עור כ- 100 ס"מ והתאם את גובה ספת הטיפול כדי ליישר את רמת פני השטח הבינונית לרמת הלייזר. לספק את המינון שהוקצה לכל צלחת ברצף. לאחר מכן, קח את הצלחות לארון biosafety בחדר תרבות התא.
החלף את המדיום בכל באר בשני מיליליטר של מדיום 1640 שהושלם. תרבות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני, הקפדה לשנות את המדיום כל שלושה עד חמישה ימים. שבעה עד עשרה ימים לאחר הקרינה, להסיר את המדיום בקצרה לשטוף את התאים עם PBS.
במכסה המנוע של האדים, הוסיפו מיליליטר אחד של 4% פורמלדהיד לכל באר כדי לתקן את התאים למשך 10 דקות. לאחר מכן, להסיר את פורמלדהיד ולשטוף כל באר פעמיים באמצעות שני מיליליטר של מים מזוקקים עבור כל לשטוף. הוסיפו מיליליטר אחד של תווי כתם סגול קריסטל 1% לכל באר והכתימו במשך 10 דקות.
לאחר מכן, להסיר את פתרון הכתם סגול קריסטל ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם מים מזוקקים. מוציאים את המים ונותנים לצלחות להתייבש במשך 30 דקות. ספור את מספר המושבות עם יותר מ-50 תאים.
במחקר זה, הן אלפא שתי דלתא אחד גבוה אלפא שני דלתא אחד נמוך A549 תאים ממוינים. סמנים מסוימים עשויים להראות אוכלוסיות נפרדות וקל לשער. עם זאת, סמנים מסוימים פשוט מראים דפוסי ביטוי גבוהים ונמוכים, ולא אוכלוסיות חיוביות ושליליות ייחודיות.
במצב זה, בקרת isotype חשוב מאוד עבור gating. הביטוי של אלפא 2 דלתא אחד בתאים ממוינים מאומת על-ידי qPCR. הביטוי של CACNA2D1, הגן המקודד אלפא שתי דלתא אחת, הוא גבוה יותר אלפא ממוין שני דלתא תאים גבוהים אחד לעומת אלפא שני דלתא תאים נמוכים אחד.
מורפולוגיה אופיינית של ספירות ויעילות היווצרות הכדור מוצגת כאן. אלפא שני דלתא תאים גבוהים אחד להראות יעילות היווצרות כדור גבוה יותר, מה שמרמז על יכולת התחדשות עצמית גבוהה יותר. תמונות אופייניות של מושבות ועקומות הישרדות מוצגות כאן.
מושבה עם כ-50 תאים יכולה להיבדק תחת מיקרוסקופ ולסמן אותה כהפניה. מספר המושבות נספר, ואז ניתן לחשב שבר הישרדות בכל מנה ונוכנה עקומת הישרדות. אלפא שני דלתא תאים גבוהים אחד עמידים יחסית לקרינה לעומת אלפא שני דלתא תאים נמוכים אחד.
כל שלב הקשור לתרבות התאים צריך להתבצע בארון הבטיחות הביולוגי או בספסל הנקי למינארי. כדי למנוע זיהום, מומלץ להוסיף אנטיביוטיקה למדיום התרבות לאחר המיון. כאשר סמן תאי גזע סרטן putative מזוהה מראש על ידי בדיקת היווצרות הכדור, אפיון נוסף על ידי vivo הגבלת בדיקה דילול יכול להתבצע כדי להעריך את היכולת tumorigenic.
ממחקר המנגנון של radioresistance, החוקרים יכולים לבחון את החלבון הקשור לתיקון נזק DNA, אישור של מיני חמצן תגובתי, ומעצר מחזור התא בתגובה לקרינה. במהלך קרינת התא, שים לב כי המאיץ ליניארי יכול להיות מופעל רק על ידי טכנאים מוסמכים. תתרחק מקרינה.
בעמידה, שים לב כי פורמלדהיד הוא הפכפך ומסוכן. השתמש בפורמלדהיד במכסה המנוע של האדים.
