UV נרגש בדיקות ברבים, יש זיהום אות אינהרנטי, בגלל צלילי ברבים אוטומטיים. רוב הבעיה עם NADH, היא הגבלת השימוש בבדיקה ברבים. ניתן להשתמש בשיטה, כדי לתקן במדויק את הצמחייה החיצונית מ NADH, על מנת לחלץ אות בדיקה ברבים אמיתי, לא מזהם.
הדגמת ההליך תהיה ג'ונג הון לי, עוזר המחקר שלנו פרופסור מהמעבדה שלי. לאחר מתן אפשרות למיוציטים להתיישב בתחתית הצינור, שאף את העל-טבעי. סמן את התאים עם שני מיליליטר של פתרון דילול מילימולרי אחד מילימולרי של fura-2-FFAM למשך 60 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
בסוף הדגירה, מניחים את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות במצב זקוף לפני הסרת העל-טבעי. לאחר מכן הוסיפו ארבעה מיליליטר של מדיום תרבות טמפרטורת החדר לאחסון בטמפרטורת החדר. עבור situ isobestic fura-2-FFA נקודת זיהוי להרים את התאים מדולל על שלב מיקרוסקופ ולחכות שלוש דקות לתאים לשקוע לתחתית.
שפע ללא NADH 37 מעלות צלזיוס ללא סידן פתרון לתוך תא התרבות ולאתר תא היעד. יש לפרופות בתתברית סאפונין למשך 60 שניות לפני שתתמזגו מחדש עם הפתרון נטול הסידן נטול NADH. בו זמנית למדוד את אותות פרווה-2-ff הנפלטים ב 450 ו 500 ננומטר, באמצעות סריקת העירור מ 350 כדי 365 ננומטר עם צעד 0.1 ננומטר מחדש בשפע עם פתרון ללא סידן NADH.
לאחר מכן להחסיר את האותות בתסכול רווי סידן מן האותות בתנאים ללא סידן. לאחר מכן חישבו את סטיות התקן של הפליטה בכל קריאה ובחרו את אורך הגל של העירור המציג את ערכי סטיית התקן המינימליים כנקודות איובסטיות בודדות. כדי להשתמש במערכת מדידה רב-פרמטרית כדי לזהות את אות הרקע ולתקן את האות בתוך אזור התא, הר תאים נטולי צבע באמבט המיקרוסקופ ואפשר לתאים להתיישב במשך שלוש דקות.
שפע NADH ללא סידן פתרון לתוך האמבטיה במשך כחמש דקות בקצב של שניים עד שלושה מיליליטר לדקה ולהגדיר את שדה האובייקט כדי לכסות את התא ממוקד. לאחר הזזת התא אל מחוץ לשדה, מודדים את אותות הרקע של החלון נטול התאים ומגדירים את האותות כהיסט. לאחר מכן החזירו את התא למיקום הראשוני ולמדוד את אותות הרקע של התא ואת אזור התא.
כדי לחשב את R-פקטור להשתמש באותות רקע התאים באזור שנרכשו לפני טעינה מחדש של התאים ללא צבע על המיקרוסקופ והשפע עם פתרון ללא סידן. למדוד את האותות כפי שצוין לפני שפע ההשעיה התא עם פתרון מאלט. לאחר מדידת האותות שפע התאים עם פתרון פירובט ואחריו שפע עם פתרון מלאט-פירובט ופתרון רוטנון.
לאחר מכן חשב את השיפוע עבור כל אות. כאן השינויים בסידן המיטוכונדריאלי לפני ואחרי התיקון מוצגים. התוצאות חושפות בבירור שינויים משמעותיים בסידן המיטוכונדריאלי עם ריכוז סידן מיטוכונדריאלי במנוחה ללא סידן ציטוסולי של 1.03 פלוס או מינוס 0.13 מיקרומולרי וסידן מיטוכונדריאלי מרבי במיקרומולר אחד של סידן של 29.6 פלוס או מינוס 1.61 מיקרומולאר.
הפוטנציאל הטרנסמברני המיטוכונדריאלי היה במעקב עם שפע של שני ננומולרים TMRE. השינוי בפוטנציאל המיטוכונדריאלי חושב בהתבסס על פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי מנומק של מינוס 150 מיליבולטים, המדגים ירידה NADH בתגובה לתוספת סידן, עם השפעה זניחה על פוטנציאל קרום המיטוכונדריה. ה- pH המיטוכונדריאלי לא הושפע מהעלייה בסידן המיטוכונדריאלי המושרה על ידי טעינת SNARF-1 של carboxy.
נקודות איובסטיות שגויות גורמות לתיקון שגוי של R ו- NADH. אז יש לדאוג תמיד כראוי למדוד את הרקע ללא תאים ואת אזור התא. טכניקה זו משמשת להכנת מחקרים דינמיים של סידן מיטוכונדריאלי בדליפות הביואנליטיות.
