אנליזה ניסויית של האפוטוטיק הפיקרוציט על ידי המקפאגים

הגוף שלנו מייצר אחד עד 10 מיליארד תאים אפטוטיים בכל יום. הסיווג היעיל של תאים אלה מסייע בהסרת פסולת תאים ושמירה על מלאי. שיטה זו עשויה לשמש ביישומים רבים כדי לאפיין איגוד תאים אפטוטיים בליעה על ידי סוגים רבים אחרים של תאים phagocytic.

הדגמת הליך זה יהיה Yuxuan ג'ן, טכנאי בכיר במעבדה שלי. כדי לקצור thymocytes, לאחר פתיחת חלל החזה של עכבר C57 שחור נאיבי 6, להשתמש מלקעות קצה דק מעוקל לשלוף את התימוס. מניחים את האיבר לתוך צלחת תרבות רקמות המכיל 10 מיליליטר של RPMI 1640 בינוני.

טוחנים את כל התימוס כנגד הקצוות הקפואים של שתי מגלשות מיקרוסקופ ומסננים את ההשעיה של הרקמה שנוצרת דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לצינור של 50 מיליליטר. לאסוף את thymocytes על ידי צנטריפוגה ולתלות את גלולה ב 40 מיליליטר. לאחר הספירה, צנטריפוגה התאים שוב resuspend עד פעמיים 10 לשמונה תאים ב 20 מיליליטר של PBS טרי לכל צינור 50 מיליליטר.

סמן את התאים עם חמישה CFSE מיקרומולרי ב 20 מיליליטר של PBS לכל צינור. הפוך את הצינורות פעמיים עד שלוש פעמים כדי לערבב לפני דגירה thymocytes במשך לא יותר משתי דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, לעצור את התגובה עם 10 מיליליטר של חום מושבת סרום סוס ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.

תן שימוש חוזר בתאים המסומנים ב-40 מיליליטר של PBS טרי לספירה וצנטריפוגה ואחריו שטיפה נוספת עם 40 מיליליטר של מדיום. לאחר שטיפה בינונית, להשתמש מחדש thymocytes ב 7 פעמים 10 לשישה תאים למיליליטר של רקמות תרבות ריכוז בינוני וזרע את התאים בצלחת 100 מילימטר רקמה. לאחר מכן הוסיפו סטאורוספורין לתרבות התאים בריכוז סופי מיקרומולרי אחד וה מניחים את הצלחת באינקובטור של תרבות הרקמות במשך ארבע שעות.

לבידוד מקרופאג צפק, הזריקו שני עכברים שחורים C57 6 תוך-אפית עם מיליליטר אחד של תיוגליקולאט בגיל 3% ביום אפס לפני פתיחת עור הבטן מבלי להפריע לפריטון ביום החמישי. כדי לשטוף את חלל הצפי, השתמש מזרק 10 מיליליטר מצויד מחט מד 18 לדחוף במהירות 10 מיליליטר של חיץ לשטוף לתוך החלל לפני שאיפה איטית את מאגר לשטוף לאוסף לתוך צינור 50 מיליליטר. לשטוף את שטיפת צבד פעמיים עם PBS.

תן שימוש חוזר במאקרופאגים צפי פעמיים 10 לשישה תאים למיליליטר של ריכוז בינוני של תרבות הרקמות. הזרע הבא 500 microliters של מקרופאגים לתוך כל באר של צלחת 24 גם למקם את הצלחת באינקובטור תרבות רקמות במשך שעתיים. בסוף הדגירה, שאפו את העל-טבעי כדי להסיר את התאים הצפים ולהוסיף 500 מיקרוליטרים של מדיום של תרבות רקמות לכל באר.

מיד להוסיף אפס ל 12 פעמים 10 לשישה thymocytes ב 500 microliters של בינוני לכל באר של התרבות ולמקום את הצלחת באינקובטור תרבות הרקמה במשך ארבע שעות. בסוף הדגירה, לשטוף כל טוב פעמיים עם PBS טרי כדי להסיר את כל התאים apoptotic צף חינם ואחריו לשטוף אחד עם חיץ כתמים. לאחר מכן תייג את המקרופאגים הקשורים לצלחת עם 200 מיקרוליטרים של מאגר כתמים בתוספת נוגדן אנטי-CD11b מתאים ל הבאר והצב את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

בניסוי מייצג זה, עד 30% מהמקרופאגים התיוגליקולטים הממריצים את ה- peritoneal הפגינו איתות חיובי בערוץ CFSE המציין כי phagocytes אלה בלעו תאים אפופוטוטיים המסומנו על ידי CFSE. תצפית מיקרוסקופית של אפילוף מקרופאג של תאים אפופטיים חיונית לחקירת היכולת של מקרופאגים לבלוע תאים אפטוטיים כמו מקרופאגים חיוביים CFSE פרושים ברביע הימני התחתון בשל התעצמויות שונות המציין כי מספר תאים apoptotic בתוך מקרופאגים בודדים שונה. יחס גבוה יותר של תאים אפופטיים למאקרופגים לא רק מגדיל את מספר המקרופגים הנבלעים תאים אפופטיים, אלא גם משפר את היכולת של המקרופגים לבלוע יותר תאים אפופטיים.

בסדרה אחרת של ניסויים, כ -15% מהמקרופאג'ים הפכו לחיוביים CFSE כאשר CFSE שכותרתו thymocytes apoptotic נוספו לתרבות המקרופאז 'במשך ארבע שעות המציין כי מקרופאגים אלה היו מקרופאגים phagocytic. הנוגדן Mer חוסם את יעילות המקרופאגים באופן תלוי מינון והחסימה הכוללת עשויה להיות אחראית ל-30% מיעילות היעילות של היעילות בסביבה הנוכחית. בנוסף, מעכב קולטן TAM שאושר לאחרונה מחליט את יעילות המקרופאז' באופן תלוי מינון עד לריכוז של כ -100 ננומולרים.

זכור תמיד לבדוק את אחוז התאים apoptotic כמו מספר זה משפיע ישירות על היעילות של efferocytosis. מקרופאגים phagocytic ניתן לנתח עוד יותר על ידי כתם מערבי כדי לחקור את מולקולות איתות מוסדר על ידי תהליך אפילציה על ידי מיקרוסקופיה כדי לחקור את הדינמיקה של אפילציה.