בדיקת מחוץ גופית מבחן להערכת כלבת חיסון עוצמת

במטרה להפחית את הניסויים בבעלי חיים ובגלל השונות של מבחן NH, ארגון הבריאות בעולם מעודד לפתח גישות במבחנה להערכת עוצמת החיסון נגד כלבת. בדיקה זו ELISA מראה קונקורדנס טוב עם בדיקת NH קלאסית בזיהוי הצורה האימונוגנית של גליקופרוטאין, מראה רגישות גבוהה, והוא יכול להתבצע בתוך יום אחד בלבד. הערכה של עוצמת החיסון נגד כלבת במבחנה על ידי ELISA היא חלופה למבחן NH in vivo.

הוא מקודם על ידי היצרנים ומעבדות הבקרה הלאומיות. זה קריטי כדי להפיץ כרכים בגודל מראש כפול עבור כל דילול כדי לייבש היטב את הצלחת על נייר סופג לאחר שטיפה כדי למנוע כדי להתחיל בהליך זה, לשים על ציוד הגנה אישית נאותה כולל מעיל חד פעמי, כפפות, מסכה, ושקפיים. לטפל בחומרים מזוהמים על ידי טבילה אותו בתתיק של 2.6% hypochlorite נתרן במשך 30 דקות עבור טיהור.

לאחר מכן, להגדיר צלחת immunoassay 96-well ולהוסיף 200 microliters של נוגדן חד שבטי מדולל במאגר קרבונט לכל באר. מכסים את הצלחת בסרט דבק ודגירה את המיקרופלסטיק ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות בסביבה לחה. לאחר מכן בזהירות שאפו והעברו את תוכן הבאר לנמען המכיל פתרון של 2.6% נתרן היפוכלוריט.

להפוך את המיקרופלסטיק ולתת לו להתייבש על נייר סופג בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. ראשית, להוסיף 300 microliters של מאגר פסיבציה לכל באר. מכסים את הצלחת בסרט דבק ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.

לאחר מכן, להעביר את התוכן של הבאר לאחד המכיל פתרון של 2.6% hypochlorite נתרן. כדי לשטוף את הצלחת, להוסיף 300 microliters של מאגר הכביסה לכל באר. לאחר מכן שאפו בזהירות והעבירו את תוכן הבאר לנמען המכיל פתרון של 2.6% נתרן היפוכלוריט.

חזור על תהליך כביסה זה חמש פעמים נוספות כדי לשטוף בהרחבה את הצלחת רגיש. לאחר מכן, להפוך את המיקרופלסטיק ולתת לו להתייבש על פיסת נייר סופג בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת. לשחזר את החיסון התייחסות במיליליטר אחד של מים מזוקקים, כך הריכוז הסופי של נגיף הכלבת גליקופרוטאין הוא 10 מיקרוגרם למיליליטר.

הכינו דילול פי 10 של חיסון הייחוס המשוחזר בדילול כדי להגיע לריכוז גליקופרוטאין של נגיף כלבת של מיקרוגרם אחד למיליליטר. לאחר מכן, בצע שישה דיללולים סדרתיים של פי שניים של חיסון ייחוס זה בדילול כפי שמתואר בטבלה אחד מפרוטוקול הטקסט. להפיץ 200 microliters של diluent בארות כפולות לשמש שליטה עיוורת 200 microliters לגם עבור כל דילול חיסון התייחסות כפול.

לאחר מכן הכינו דילול פי 10 של החיסון שנבדק בדילולנט והכינו שבעה דילולים סדרתיים של החיסון שנבדק בדילול כפי שמתואר בטבלה 2 של פרוטוקול הטקסט. להפיץ 200 microliters של כל דילול חיסון נבדק כפול לכל באר של microplate. מכסים את המיקרופלאט בסרט דבק ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.

לאחר מכן, הסר את הסרט. שאפו בזהירות והעבירו את התוכן של כל באר לנמען המכיל פתרון היפוכלוריט נתרן 2.7%. כדי לשטוף את הצלחת, להוסיף 300 microliters של חיץ כביסה לכל גם, שאפו בזהירות ולהעביר את התוכן של כל באר לתוך נמען המכיל 2.6% פתרון hypochlorite נתרן.

חזור על תהליך הכביסה חמש פעמים נוספות כדי להסיר את האנטיגן הלא מאוגד ול לשמר את טרימרים G-חלבון קשור הנוגדן מצופה. להפוך את המיקרופלסטיק שטוף ולתת לו להתייבש על פיסת נייר סופג בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת. לאחר מכן להפיץ 200 microliters של הדילול המומלץ של פרוקסידאז שכותרתו D1 נוגדן חד שבטי diluent לכל באר.

מכסים את המיקרופלאט בסרט דבק ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן, הסר את הסרט, שאף בזהירות והעבר את התוכן של כל באר לנמען המכיל פתרון היפוכלוריט של 2.6%. כדי לשטוף את המיקרופלסטיק, הוסיפו 300 מיקרוליטרים של חיץ כביסה לכל באר.

שאפו בזהירות והעבירו את התוכן של כל באר לנמען המכיל 2.6% פתרון hypochlorite נתרן. חזור על תהליך כביסה זה חמש פעמים נוספות כדי להסיר את נוגדן peroxidase לא מאוגד שכותרתו. להפוך את המיקרופלסטיק שטוף ולתת לו להתייבש על פיסת נייר סופג בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת.

לאחר מכן, להפיץ 200 microliters של פתרון כרומוגן מצע לתוך כל באר. לאטום את המיקרופלאט עם סרט צילום ודגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 30 דקות. לאחר מכן להוסיף 50 microliters של פתרון עצירה לתוך כל באר כדי לעצור את התגובה.

בזהירות לנגב את החלק התחתון של המיקרופלסטיק ולה למקם אותו ספקטרופוטומטר. לקבוע את הצפיפות האופטית ב 492 ננומטר עבור כל בארות בשימוש. אסוף נתונים אלה בקובץ גיליון אלקטרוני לצורך ניתוח.

לאחר מכן, צור חלקות הן עבור עקומת החיסון הייחוס והן עבור ערכי הצפיפות האופטית כמתואר בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, הבדיקה במבחנה ELISA משמש להערכת עוצמת החיסון נגד כלבת. ערכי צפיפות אופטית מייצגים מניסוי טיפוסי מוצגים כאן.

ערכים אלה משמשים כדי לצייר את עקומת החיסון התייחסות על ידי התוויית הצפיפות האופטית הממוצעת עבור דילולים שונים של חיסון הייחוס על הציר האנכי ואת הריכוז של גליקופרוטאין על הציר האופקי. תוכן הגליקופרוטאין של החיסון שנבדק מוערך לאחר מכן באמצעות עקומה זו. ההערכה מדויקת עבור דילולים בעלי ערך צפיפות אופטית ממוצע באזור אניה של עקומת החיסון התייחסות.

אם לוקחים בחשבון את הדילול של אחד עד 40, ההקרנה האנכית של OD 1534 על ציר ה- x תואמת ל- 500 ננוגרם למיליליטר. אז החיסון שנבדק מוערך ב-20 מיקרוגרם למיליליטר של גליקופרוטאין. כאשר הוקמה העוצמה במבחנה, יש להשוות את החיסון שנבדק להתייחסות שישה תקן בינלאומי של ארגון האו"ם מכויל ביחידות בינלאומיות.

ניתן להשתמש באותה שיטה עם נוגדנים אחרים כדי להגדיל את הגילוי של זנים חיסונים נוספים, כולל אלה המשמשים בחיסונים וטרינריים שהם קלאסיים יותר משתנים. נוגדנים יכולים לשמש גם בתחרות על טיטרציה של נוגדנים נגד רבי בסוסים או בסרום אנושי. יש לנקוט אמצעי זהירות עם חיסונים אינם מושבתים או עם וירוסים.

הקפד להשתמש בציוד מגן אישי, ללבוש כפפות לטהר הכל כראוי. כמו כן, להיזהר עם טבליות של כפי שהם מסרטנים עם פתרון hypochlorite נתרן חומצי.