הליך זה מספק גישה אופטית חוזרת ונשנית להיפוקמפוס הגבי של עכברים חיים כדי ללמוד את המנגנונים של היווצרות הזיכרון ולהזכיר בזמן שהם מבצעים משימות למידה. טכניקה זו מאפשרת שימוש במיקרוסקופיה קלה כדי לחקור את ההיפוקמפוס הגבי של עכברים חיים ברמת מיקרומטר רזולוציה מרחבית לאורך מספר שבועות. אובדן זיכרון הוא סימן ההיכר הכללי של כמה מחלות מוח כגון מחלת אלצהיימר.
הבנת המנגנון של היווצרות הזיכרון וההיזכרות יכולה בסופו של דבר לעזור לחולים הסובלים ממחלות אלה. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מערכות אחרות של בעלי חיים עם גולגולת כגון יונקים קטנים. ניטור סימנים חיוניים במהלך ניתוח הישרדות יכול להיות גם מסיח את הדעת וגם מלחיץ.
זה עשוי להיות שימושי לבצע תחילה את ההליך על בעל חיים מת על מנת להתמקד בהיבטים הקריטיים יותר של ההליך. כדי להכין את צינורית ההדמיה, ראשית לחתוך צינור נירוסטה בקוטר שלושה מילימטר לתוך טבעת מתכת 1.6 מילימטר ארוך. אם הקצוות של הטבעת אינם בוטה לאחר חיתוך, להגיש את אי סדרים.
לאחר מכן, השתמש בזוג מדפים כדי לטבול צד אחד של טבעת המתכת לתוך דבק אופטי ריפוי UV. לאחר מכן מקם את טבעת המתכת במרכז כיסוי זכוכית עם הצד של הטבעת מכוסה דבק נוגע בכיסוי. הפעל את יחידת הנהג LED ריפוי UV ולהאיר 365 ננומטר אור אורך גל על דבק במשך דקה אחת כדי לרפא את דבק.
ודא שכל צידי הטבעת מוארים באותה מידה על-ידי שינוי כיוון מקור האור. לאחר דבק התקשה במשך לפחות שעתיים, בחוזקה להחזיק את cannula מהקצה הפתוח של טבעת המתכת באמצעות המוסטט. באמצעות מקדחה שיניים מצויד בקובץ מסתובב, להגיש את כיסויי זכוכית עודף עד שהוא סמוק עם הצדדים של הטבעת.
הכן את הכלים הדרושים והרס את העכבר כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן להסיר את השיער ולחטא את העור מעל ראש העכבר. לאחר מכן, השתמש מספריים ומדפים לעשות חתך קטן בקרקפת בתצב קרוב lambda.
לנוע באופן משני לכיוון האוזניים ואז rostrally לכיוון מסלולי העין כדי ליצור משולש על הציר הסגיטלי כארבעה מילימטרים rostral כדי bregma. החל טיפה אחת של לידוקאין על הגולגולת. לאחר שתי דקות, לנקות את periosteum ולייבש את הגולגולת באמצעות ספוגית כותנה.
לאחר מכן מקם את מוטות האוזן כדי לתקן את ראש העכבר. באמצעות מקדחה מיקרו עם בר ברוחב 0.5 מילימטר, לעשות חור קטן בעצם הקדמית מול ההיפוקמפוס בתמונה כ 1.5 מילימטרים מן התפר sagittal ושני מילימטרים דיסטל מתפר הכתר. ואז לדפוק בורג עצם נירוסטה ברוחב 0.86 מילימטר לתוך חור הגולגולת.
לאבטח אותו במקום באמצעות מלט דבק. תן למלט להתייבש במשך 30 שניות עד דקה. לאחר מכן, השתמשו במקדחת טרפין בקוטר שלושה מילימטרים כדי ליצור חור קטן בעצם קודקודית.
מקם את החור כ 1.5 מילימטרים דיסטלי מן התפר sagittal ושני מילימטרים דיסטלי מן התפר lambdoid. בזהירות להסיר את דש העצם. ואז להסיר את קרום ההתהוות באמצעות מדפים Dumont.
חומר קליפת המוח אבלט להגיע הקפסולה החיצונית. השתמש מחט קהה 19 מד מחובר משאבת ואקום להשקות עם מלוחים, כדי למנוע התייבשות של הרקמה החשופה לשטוף את כל הדם שיורית לאחר הדימום נפתר. למצוץ רקמת קליפת המוח לאט על 50 עד 100 מיקרון בכל פעם עד קליפת המוח מתנתקת מן הקפסולה חושף את הסיבים של cingulum או כפיס המוח.
ואז בזהירות לקלף את הסיבים הגביים עד הסיבים העמוקים ביותר, מכתש של ההיפוקמפוס נחשפים. בסיום, לשטוף את הרקמה עם מלוחים. לאחר מכן, השתמש במפולות דקות כדי לטבול את ה Cannula התחתון לתוך מלוחים ולמקם אותו מעל חור הגולגולת.
ואז לדחוף את cannula לתוך הגולגולת עד כיסוי הזכוכית הוא במגע עם הסיבים. יבש את הגולגולת ולהחיל מלט דבק מהיר על הגולגולת להחזיק את cannula במקום. הקפד גם להחיל דבק על שפת cannula אבל להיזהר לא לתת דבק לרוץ לתוך cannula.
לאחר התייבשות, השתמש בזרוע סטריאוטוקסית כדי למקם צלחת מחזיק ראש מעל הגולגולת במגע עם הגולגולת. מכינים תערובת של אקריליק דנטלי ולאחר מכן להחיל אותו על פני הגולגולת כולה. מכסים את כל הגולגולת החשופה, את הבורג ואת העור הפתוח עם אקריליק שיניים כדי לייצב את ההכנה.
לאחר 15 דקות, יש למרוח סרט דבק נשלף על לוחית מחזיק הראש כדי למנוע כניסת פסולת לתוך הקנולה. כאשר אתה מוכן לדמיין את המוח, בצע שוב בפרוטוקול הטקסט הנלווה לקבלת פרטים על הרדמה. לאחר הרמת מספיק, השתמש במדפים כדי להסיר בזהירות את סרט דבק מצלחת מחזיק הראש.
הסר את הסרט בעדינות כדי למנוע פגיעה בהכנה. לאחר מכן, מקם את העכבר מתחת למיקרוסקופ מעל שטיח החימום ואבטח את לוחית הראש למחזיק. יש למרוח משחת עיניים על עיני החיה.
לאחר מכן לנקות את cannula הדמיה באמצעות מזרק ומחט דקה כדי להפיל מים deionized לתוך cannula ואחריו הסרה עם משאבת ואקום. השתמש בהגדלה נמוכה מטרות מרחק עבודה ארוכות כדי לבדוק חזותית את ה cannula עבור מים שיורית, לכלוך, שלמות ואת נוכחות של פלואורסצנטיות. לאחר מכן ליישר את cannula לציר האופטי על ידי התאמת הזוויות של זרועות מחזיק הראש.
עבור למטרה 25X עם צמצם מספרי של 1.0 ובמרחק עבודה של ארבעה מילימטרים. לאחר מכן מוסיפים מספיק מים deionized ל cannula כדי למלא אותו ולשמור על מים עודפים על גבי cannula. לבסוף, השתמש בשני עירור פוטון ודמיין את אותות הפלואורסצנטיות.
מוצג כאן הוא מחסנית תמונה 2P ממוח עכבר מהופנט thy1-GFP. עכברי Thy1-GFP מבטאים GFP משופר ציטופלסמי תחת שליטתו של מקדם Thy1 באוכלוסייה אקראית דלילה של נוירונים פירמידליים. בדרך כלל, הציר העיקרי של נוירונים פירמידליים ב CA1 ההיפוקמפוס הגבי הוא בערך בניצב למישור הדמיה XY.
אזורים אלה ממופים ידנית לערימה תלת-ממדית של הגדלה נמוכה המציגה את התבנית של ביטוי GFP באמצעי האחסון שמתחת לעצם הדימות. למעקב אורך, מספר אזורי מוח בתוך שדה התצוגה של cannula מוגדרים. כל אזור מתאים לאזור של כ 240 על ידי 240 מיקרומטר ומכיל בין אחד לשבעה מקטעים דנדריטיים.
הסדרה בתמונה כאן מציגה ערימות תמונה אחת מיקרומטר z-צעד של תאי עצב פירמידלי CA1 ודנדריטים בסיסיים שנרכשו במרווחי זמן שונים במשך 14 ימים. עם זאת, משכי דימות ומרווחי זמן ארוכים יותר אפשריים. למרות שרוב התמונות הן של קוצים דנדריטיים בשכבות אוריינס, ניתן גם לדמיין קוצים דנדריטיים בדנדריטים אלכסוניים של רדיאטום השכבות.
הרחבה נוספת של טכניקה זו היא תמונה פעילות עורר פלסטיות בתאי עצב פירמידלי CA1 על ידי הזרקת אזור ההיפוקמפוס CA1 הגבי עם וקטור ויראלי. זה מאפשר את הפלסטיות של מאות תאי עצב פירמידליים CA1 בכל חיה להימדד המוצג כאן כמו ערימת תמונה 2P. זה חיוני כדי למנוע נזק ההיפוקמפוס בעת הסרת הרקמה overlying.
בנוסף, יש למקם את cannula כראוי כדי להבטיח הכנה יציבה. ההכנה המתוארת מאפשרת שימוש בסוגים שונים של הדמיה אופטית כגון מיקרוסקופים זעירים שניתן להשתיל על ראשו של בעל החיים. זה מאפשר לחוקר לעקוב אחר פעילות עצבית בבעלי חיים הנעים בחופשיות.
במקור, הטכניקה שימשה לחקר פלסטיות מבנית בנוירונים בהיפוקמפוס. כיום, הוא מיושם בחקר פעילות עצבית גם באזורים אחרים במוח.
