עבודה זו נתמכה על ידי מענק הפעלה של המחלקה של פתולוגיה, אוניברסיטת יוטה כדי J.C.S.B.

1. זיהוי מוטציות חיזוי סינרגיה מפני כימיה-גנטיקה Dataset בשיטה2 חפיפה (O2M)
הערה: זו השיטה לזיהוי מוטציות חיזוי סינרגיה באמצעות את ערכת הנתונים שפורסמו החל ניקולס ואח. 17 ב e. coli. עם זאת, ניתן לבצע זאת על כל ערכת נתונים כימיים-גנטיקה, מיקרואורגניזם. ערכות נתונים אלה מכילים ספריה של נוקאאוט מוטציות גדל בנוכחות מולקולות קטנות יותר מ-100, נותן ציון כמותי צמיחה עבור כל מוטציה בתוך כל מולקולה קטנה. זוג סינרגטי אחד חייב להיות ידוע, היו הציונים הצמיחה של שתי מולקולות קטנות הכלולים ב- dataset.
<ol><li>
לחשב את הציון הצמיחה הממוצע וסטיית התקן לכל. המוטנטים גדל בנוכחות ריכוז יחיד של כל מולקולה קטנה. הערה: ניתן לבצע זאת באמצעות תוכנה כלשהי של גיליון אלקטרוני. המעבדה חום משתמשת ב- Excel ו הפונקציות =AVERAGE(B3:B3981) ו- =STDEV(B3:B3981) עבור החישובים של כל אחת מהעמודות של מולקולה קטנה.<ol>
<li>לחשב את האמצעים ואת סטיות תקן של כל אחת מהעמודות של מולקולה קטנה, אך נטייה זו עשוי להיות שונה אם משתמש dataset שונים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חישוב ציוני Z עבור כל ריכוז של מולקולה קטנה באמצעות את ערכת הנתונים זהה של ניקולס ואח. 17 בתוכנית גיליון אלקטרוני. בשביל זה, ציוני z שליליים יהיה Z(2.5) = כלומר - 2.5 * סטיית תקן, ציוני z החיובי יהיה Z(2.5) = ממוצע + 2.5 * סטיית תקן.</li>
	<li>לקבוע אילו גנים מוטנטים מכילות ציונים Z משמעותית מולקולות קטנות המרכיבות את זוג סינרגטי ידוע, להיות בטוח להסתכל על כל ריכוזי המולקולות האלו. אם הגידול הציון של מוטציה הוא פחות מז שלילי (2.5) ניקוד או גדול מהניקוד Z (2.5) חיובי עבור מולקולה קטנה זו, הוא נחשב משמעותי.</li>
	<li>לקבוע אם כל המוטציות ג'ין משמעותי שייך אופרון. הערה: עבור e. coli, המחברים ממליצים לבדוק "Ecoli wiki" לקבלת מידע בנוגע אם הגנים הם עיבד כחלק polycistronic RNA.</li>
	<li>לזהות מוטציות גנים/אופרון המשותפות הרוב של מולקולות קטנות עניין בריכוזים שונים (למשל., כאשר מחפשים מולקולות שמקושרות עם וטרימטופרים לאנטיביוטיקה, לזהות מוטציות המציגים Z משמעותית ניקוד כאשר גדל בנוכחות וטרימטופרים ושותפיה סינרגטי ידועים כגון sulfamethizole או sulfamethoxazole). אלה סינרגיה בשם חיזוי מוטציות.</li>
</ol>2. חיזוי Synergizers בתוך ערכת הנתונים כימית-גנטיקה על ידי O2M
<ol><li>שחזר הנתונים (dataset)17, לזהות כל ריכוז של מולקולה קטנה ולחושים ניקוד צמיחה משמעותית מ החשבונאי חיזוי סינרגיה. פעולה זו מתבצעת על ידי הסתכלות על ציוני Z מחושב עבור כל ריכוז של מולקולות קטנות. שוב, ציון צמיחה משמעותית הוא פחות מאשר התוצאה Z שליליים או גבוה יותר הציון Z חיובי עבור הריכוז של מולקולה קטנה. הערה: אם מולקולה מופיע אפילו באחד הריכוזים שלה, מולקולת נחשב של synergizer החזוי. כל מולקולה אשר לא זכה ניקוד צמיחה משמעותית היא החזוי הלא-synergizer.</li>
</ol>3. אימות של אינטראקציות סינרגטי חזויים
<ol><li>מציאת הריכוז המעכב מינימלי (MIC) של synergizers החזוי.
	<ol>
<li>לגדול תרבות לילה של e. coli בתקשורת מינימלי M9 ב 37 º C. הערה: ניתן לגדל כל תרבות לילה במדיום מוגדר כהלכה עבור האורגניזם עניין. המעבדה חום אינה ממליצה על מדיה עשירים כמו ליברות או YPD. M9 תקשורתי מזערי מורכב 10.5 g/L M9 מרק, חומצות casamino 0.2%, 0.1 M CaCl2, 0.4% גלוקוז, 1 מ' MgSO4, 0.25% nicotinic חומצה ו תיאמין 0.33% H2O.</li>
		<li>אם אין נתונים מיקרופון הפתוגן עניין זה נמצא בספרות כשקיבלנו את מולקולות קטנות, להמיס דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)-ריכוז גבוה (> 10 מ"ג/מ"ל).</li>
		<li>באמצעות צלחת 96-ובכן, להוסיף 100 µL של התקשורת M9 מכל קידוח. להוסיף על µL תוספת 100 של מדיה M9 בעמודה 1 אז הוא מכיל סכום כולל של 200 µL.</li>
		<li>להוסיף כמות שרירותית (~ 10 µL) של מולקולה קטנה מרוכז פתרון בעמודה 1. מולקולה קטנה אחת לכל טוב של עמודה 1 (8 מולקולות קטנות לכל צלחת). הערה: אלה מולקולות קטנות של עניין, הם חזו לצוות. המעבדה חום בדרך כלל מוסיף 10 µL של מולקולה קטנה מרוכז פתרון, אשר מתחת כמות דימתיל סולפוקסיד 100% זה יכול לעכב e. coli.</li>
		<li>ברגע מולקולות קטנות נוספו, לדלל את מולקולות קטנות לאורך ציר ה-x של הצלחת. קח 100 µL של פתרון מעמודה 1, שמים בטור 2 ומערבבים. קח 100 µL מעמודה 2, מקום בעמודה 3 ומערבבים. המשך בתהליך זה עד 100 µL ממוקמים בעמודה 11. לערבב טור 11, ואז לקחת את µL 100 מ עמודה זו, למחוק. השאר את העמודה 12 עם מדיה רק כדי לנרמל את הנתונים.</li>
		<li>לחסן את הצלחת. להשיג את הצפיפות האופטית (OD600) מתרבות לילה. להכין פתרון עם התרבות, המדיה M9 יתר600 של 0.002 (או מתאים ריכוז המייצג 500 תאים/µL עבור האורגניזם הרצוי עניין). פיפטה 2 µL של תרבות פתרון לבאר כל צלחת אז יש תאים 1,000 לכל טוב.</li>
		<li>בעדינות לנער את הצלחת והשג את יתר600 עבור ה 0 קריאה. תן את הצלחת לגדול ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 ח קבל יתר600 עבור 24 שעות קריאה. הערה: השימוש המתאים גדל תנאים עבור אורגניזמים אחרים מעניינים.</li>
		<li>לחשב את הצמיחה נטו עבור כל טוב באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני.</li>
		<li>ממוצע הצמיחה נטו של עמודה 12 כדי לקבל הממוצע אין גידול סמים. לנרמל את הבארות אחרים לממוצע של אין גידול סמים באמצעות תוכנת הגיליון האלקטרוני. אחפש בכל טוב עם פחות מ- 10% צמיחה כדי לזהות את MIC90. כל טוב עם פחות מ- 50% צמיחה מציין את MIC50. לחשב את הריכוז של מולקולה קטנה בבארות האלה.</li>
	</ol></li>
	<li>לוח שחמט מבחני עבור אינטראקציות סינרגטי
	<ol>
<li>לגדול תרבות לילה של e. coli בתקשורת M9 מינימלית כמו בעבר. הערה: השימוש המתאים גדל התנאים עבור אורגניזמים אחרים.</li>
		<li>להוסיף 100 µL של התקשורת M9 כל טוב של צלחת טוב 96 ו µL תוספת 100 בעמודה 1.</li>
		<li>הוספת מולקולה קטנה את הבדיקה (~ 8 x מיקרופון) לכל אחד טוב בעמודה 1 ולהוסיף להכפיל את הריכוז (~ 16 x מיקרופון) ל A1 טוב (מולקולה קטנה אחת נבדק לכל צלחת). הערה: סכום זה נקבע מן המנזר הנסוי מיקרופון, שונה עבור כל synergizer פוטנציאליים.</li>
		<li>צור לדילול ההדרגתי בציר ה-x על-ידי לקיחת µL 100 מעמודה 1 העברת לעמודה 2. המשך בתהליך זה עד 100 µL להוספת עמודה 11. לערבב, ואז לקחת את µL 100 מעמודה 11, להיפטר. אל תוסיף כל סם כדי עמודה 12 (איור 1 א').</li>
		<li>להגדיר את המילוי ההדרגתי התרופה השנייה לאורך ציר ה-y עבור התרופה קלט. להוסיף 100 µL של המדיה המכילה 2-מיקרופון של המולקולה הקלט בשורה ערבוב א ו- µL 100 שתדללו כמו בעבר, לוקח מן השורה A והצבת ב' המשך עד 100 µL תוצב בשורה ג מיקס, לקחת 100 µL ו השלך, הבטחת לא כדי להוסיף כל סם הקלט בשורה ה דבר זה מאפשר H ועמודה 12 כדי להכיל מיקרופונים בודדים של זוג סמים שנבדקו (איור 1B).</li>
		<li>לחסן את הצלחת. להוסיף 2 µL של תרבות e. coli של יתר600 0.002 מכל קידוח (1,000 תאים לכל טוב).</li>
		<li>למדוד את יתר600 של כל טוב בצלחת בקריאת 0 h.</li>
		<li>דגירה את הצלחת במשך 24 שעות ביממה ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>למדוד את יתר600 של כל טוב בבית 24 שעות ביממה.</li>
	</ol></li>
	<li>חישוב המדד הריכוז המעכב החלקי (FICI) של משבצות
	<ol>
<li>לחשב את הצמיחה נטו לטוב כל צלחת על-ידי חיסור את יתר600 ב- h 0 מ OD600 ב- 24 שעות בתוכנית גיליון אלקטרוני.</li>
		<li>לנרמל את הצמיחה בתוכנה על ידי חלוקת כל H12 טוב מאת טוב, אשר מכיל אין מולקולה קטנה.</li>
		<li>למצוא את MIC90 של המולקולה קלט בעמודה 12, את MIC90 של synergist פוטנציאליים בשורה ה</li>
		<li>חפשו כל הבארות לעכב 90% של צמיחה.</li>
		<li>לחשב את FICI90 על הבאר או הנמוך מתחת (סינרגיסטי) או הגבוהה מעל (אויבת) בשני ערכים MIC90, באמצעות המשוואה: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57241/57241eq1.jpg">
</li>
		<li>לשקול כל ≤ FICI 0.5 כמו סינרגטי, FICI ≥ 4 כמו אויבת (איור 2). הערה: ניתן גם לבצע זאת עם MIC50 (50% עיכוב של צמיחה) כדי להגיע FICI50 בהתבסס על ערכים אלה מיקרופון.</li>
	</ol></li>
	<li>Assay העצמאות בליס הערה: עצמאות בליס מנוהל עם כל synergist פוטנציאל זה לא היה של מיקרופון בכוחות עצמו.<ol>
<li>לגדול תרבות לילה של e. coli בתקשורת M9 ב 37 מעלות צלזיוס, כמו קודם. הערה: שוב, תנאי גידול מתאימים עבור אורגניזמים אחרים עניין יכול לשמש בשלב זה.</li>
		<li>להכין צלחות 96-ובכן בדיקות המולקולה פוטנציאל סינרגטי, מולקולת קלט, השילוב, פקד שאינם מטופלים.</li>
		<li>צור את הצלחת synergist פוטנציאליים על-ידי הוספת µL 50 של מדיה M9 מכל קידוח. להוסיף 50 µL של המדיה המכילה ריכוז קבוע (מיקרומטר 10 או 100 מיקרומטר) של synergist הפוטנציאלי כל טוב של שורה. מבחן מולקולות 8 לכל צלחת.</li>
		<li>צור את הצלחת מולקולה קלט על-ידי הוספת µL 50 של מדיה בכל טוב. להוסיף 50 µL המכיל 4 x מיקרופון של הסם קלט מכל קידוח בעמודה 1. צור לדילול ההדרגתי לאורך ציר ה-x דומים ללוחות מיקרופון, לוקח 50 µL מעמודה 1, פיזור, ערבוב בטור 2. המשך בתהליך זה עד עמודה 12, חיסולו 50 µL מעמודה 12. להוסיף על µL 50 נוספים של מדיה בכל טוב אז סה כ במשך כל סוף הוא 100 µL.</li>
		<li>יצירת את הצלחת השילוב באמצעות צלחת טוב 96, להוסיף 50 µL של מדיה בכל טוב. להוסיף 50 µL המכיל 4 x מיקרופון של הסם קלט מכל קידוח בעמודה 1. לדלל לאורך ציר ה-x דומים ללוחות מיקרופון, לוקח 50 µL מעמודה 1, פיזור, ערבוב בטור 2. להמשיך את זה. כל הדרך כדי עמודה 12, חיסולו 50 µL מעמודה 12 להוסיף 50 µL של המדיה המכילה את synergist פוטנציאליים מיקרומטר 10 או 100 מיקרומטר, כדי כל טוב של שורה. שוב, צריך להיות אחד ריכוז או סמים בכל שורה.</li>
		<li>ליצור את הפקד שאינם מטופלים על-ידי הוספת 100 µL של התקשורת M9 בארות כל צלחת.</li>
		<li>לחסן כל הצלחות על-ידי הוספת 2 µL של התרבות חיידקי עם יתר600 של 0.002 או תאים 1,000 לכל גם לפני.</li>
		<li>למדוד את יתר600 של כל טוב-0 ל- 24 שעות ביממה.</li>
	</ol></li>
	<li>חישוב הציון העצמאות בליס
	<ol>
<li>לחשב את הצמיחה נטו לטוב כל צלחת על-ידי חיסור את יתר600 ב- h 0 מן הגידול ב 24 שעות ביממה באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני.</li>
		<li>לנרמל את הבארות לצמיחה ממוצעת מהצלחת סמים אין בתוכנית גיליון אלקטרוני.</li>
		<li>שימוש בתכנת, לחשב עיכוב על-ידי חיסור הגידול נטו מ- 1.</li>
		<li>ממוצע העמודות בצלחת הבקרה המכיל רק את ההדרגה קלט בתוכנת הגיליון האלקטרוני.</li>
		<li>לחשב את הציון בליס במשך כל על ידי המשוואה: בליס ציון = (X טוב + עמודת קלט X) – בשילוב X טוב
</li>
		<li>חפש תוצאות שליליות בבארות מתחת MIC90 של הקלט. הערה: ציונים שליליים על פני מספר ריכוזים יצביע על האינטראקציה סינרגטי.</li>
	</ol></li>
</ol>4. תפוקה גבוהה מסך עם מוטציות חיזוי סינרגיה לזהות זוגות סינרגטי הרומן
<ol><li>
לזהות מוטציות חיזוי סינרגיה הערה: שלב 1.5 זיהו סינרגיה בשם חיזוי מוטציות. כאן, אנחנו קובעים אשר של המוטנטים האלה יפעלו הטוב ביותר על סמים סינרגטי מסך תפוקה גבוהה. ביצענו assay הזה במכונת Bioscreen, אך הקוראים צלחת טוב 96 גם אמור להיות מקובל.<ol>
<li>לגדול כל המוטציות חיזוי סינרגיה בשם ותאים פראי-סוג בתקשורת מינימלי M9.</li>
		<li>הגדרת ה-100 הכוורת. ובכן צלחת (או צלחת טוב 96) עם מדיום הגידול המתאים, מדיום הגידול + סמים קלט, מדיום הגידול + שותף סינרגטי מוכרים סמים קלט, ואת מדיום הגידול + סמים שאינם סינרגטי ידוע. להבטיח כוללים פקדים הרכב. הערה: מומלץ שלשכפל ארבע בארות עבור כל זן/סמים/ריכוז.</li>
		<li>לחסן 1,000 תאים לכל טוב, כולל בקרה הריק בארות.</li>
		<li>לגדול h 48-37 מעלות צלזיוס, עם טלטולים, וקרא OD600 כל 20 דקות.</li>
		<li>לקבוע סמים ריכוז וזמן הנקודה המציגה את ההפרש הצמיחה הגדול ביותר בין פראי-סוג סינרגיה חיזוי תאים מוטציה בנוכחות הסם קלט ושותפיה סינרגטי ידוע. נקודת הזמן האופטימלי, ריכוז, שם לא צריך להיות רב לבין גדילה פראי-סוג תאים וסינרגיה חיזוי מוטציה כאשר גדל בנוכחות סמים ידוע לא לפעול בסינרגיה עם התרופה קלט (איור 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תפוקה גבוהה מסך לסמים סינרגטי
	<ol>
<li>לצמוח פראי-סוג תאים ותאים סינרגיה חיזוי מוטציה בתקשורת מינימלי M9. הערה: השתמש מדיום הגידול המתאים עבור אורגניזם בעל עניין.</li>
		<li>להוסיף תרופות מספריית המדיה אז כל טוב אשר מכיל 100 µL מדיה עם מולקולות קטנות על ריכוז קבוע אשר נקבע בשלב הקודם. נמנים בארות ריקים (ללא תאים) ווולס עם הרכב פקדים (e.g., דימתיל סולפוקסיד) להביא בחשבון כל עיכוב גדילה על ידי הרכב דילול סמים.<ol>
<li>להכין לפחות ארבע בארות בקרת רכב לכל צלחת, אידיאלי מפוזרים על פני הצלחת להסביר תופעות מיקום טוב. אם מבחני משתנה, ואז כוללים בקרת רכב אחד לפחות טוב לכל שורה/עמודה, השימוש בכל פקד שורה/עמודה וכן הפקד כדי לחשב ציוני Z עבור כל שורה/עמודה במקום על צלחת שלמה (שלב 4.2.5).</li>
		</ol>
</li>
		<li>להוסיף 2 µL של תרבות כל גם לפני. (לוח אחד לכל פראי סוג חיידקים וצלחת אחת עבור חיידקים מוטנטים החזוי סינרגיה).</li>
		<li>להעריך את יתר600 ב- 0 ו- 18 h e. coli או 48 שעות עבור neoformans ג.</li>
		<li>שימוש בתכנת, לחשב את הצמיחה נטו על-ידי חיסור ה OD600 של ריק בארות בארות שליטה הרכב. לזהות וולס עם Z-ציון של -2.5 (ציון Z = רשע - 2.5 * סטיית תקן). הבארות הללו מכילים מולקולה קטנה פוטנציאלי synergist.</li>
		<li>אמת מסך כניסות באמצעות השיטות המתוארות בשלב 3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Antimicrobial+Resistance+Crisis:+Causes,+Consequences,+and+Management.">The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management.</a> Front Public Health. 2, 145 (2014).</li><li>Butts, A., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+Drug+Discovery:+Something+Old+and+Something+New.">Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New.</a> PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870 (2012).</li><li>Roemer, T., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+Drug+Development:+Challenges,+Unmet+Clinical+Needs,+and+New+Approaches.">Antifungal Drug Development: Challenges, Unmet Clinical Needs, and New Approaches.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (5), a019703 (2014).</li><li>Oprea, T. I., Mestres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Repurposing:+Far+Beyond+New+Targets+for+Old+Drugs.">Drug Repurposing: Far Beyond New Targets for Old Drugs.</a> AAPS J. 14 (4), 759-763 (2012).</li><li>Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosing+the+decline+in+pharmaceutical+R&amp;D+efficiency.">Diagnosing the decline in pharmaceutical R&amp;D efficiency.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (3), 191-200 (2012).</li><li>Rangel-Vega, A., Bernstein, L. R., Mandujano-Tinoco, E. A., Garc&#237;a-Contreras, S. J., Garc&#237;a-Contreras, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+repurposing+as+an+alternative+for+the+treatment+of+recalcitrant+bacterial+infections.">Drug repurposing as an alternative for the treatment of recalcitrant bacterial infections.</a> Front Microbiol. 6, 282 (2015).</li><li>Torella, J. P., Chait, R., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+Drug+Synergy+in+Antimicrobial+Treatments.">Optimal Drug Synergy in Antimicrobial Treatments.</a> PLoS Comput Biol. 6 (6), e1000796 (2010).</li><li>Cowen, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+Hsp90+function+as+a+powerful,+broadly+effective+therapeutic+strategy+for+fungal+infectious+disease.">Harnessing Hsp90 function as a powerful, broadly effective therapeutic strategy for fungal infectious disease.</a> P Natl Acad Sci. 106 (8), 2818-2823 (2009).</li><li>Zuo, G. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Antibacterial+and+Antibiotic+Effects+of+Bisbenzylisoquinoline+Alkaloids+on+Clinical+Isolates+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+Aureus+(MRSA).">Synergistic Antibacterial and Antibiotic Effects of Bisbenzylisoquinoline Alkaloids on Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA).</a> Molecules. 16 (12), 9819 (2011).</li><li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+drug+combinations:+interaction+and+network+perspectives.">Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives.</a> Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 111-128 (2009).</li><li>Wambaugh, M. A., Shakya, V. P. S., Lewis, A. J., Mulvey, M. A., Brown, J. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+identification+and+rational+design+of+synergistic+small-molecule+pairs+for+combating+and+bypassing+antibiotic+resistance.">High-throughput identification and rational design of synergistic small-molecule pairs for combating and bypassing antibiotic resistance.</a> PLOS Biol. 15 (6), e2001644 (2017).</li><li>Brown, J. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+biology+of+a+fungal+meningitis+pathogen+using+chemical+genetics.">Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics.</a> Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).</li><li>Cokol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+exploration+of+synergistic+drug+pairs.">Systematic exploration of synergistic drug pairs.</a> Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).</li><li>Borisy, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+discovery+of+multicomponent+therapeutics.">Systematic discovery of multicomponent therapeutics.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (13), 7977-7982 (2003).</li><li>Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?+The+Saariselk&#228;+agreement+revisited.">What is synergy? The Saariselk&#228; agreement revisited.</a> Front Pharmacol. 6, 181 (2015).</li><li>Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+assessed+by+checkerboard.+A+critical+analysis.">Synergy assessed by checkerboard. A critical analysis.</a> Diagn Microbiol Infect Dis. 16 (4), 343-349 (1993).</li><li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+Landscape+of+a+Bacterial+Cell.">Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell.</a> Cell. 144 (1), 143-156 (2011).</li><li>Chandrasekaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies.">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Mol Syst Biol. 12 (5), (2016).</li><li>Pradhan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomic+profiling+of+Plasmodium+falciparum+as+a+tool+to+aid+antimalarial+drug+discovery.">Chemogenomic profiling of Plasmodium falciparum as a tool to aid antimalarial drug discovery.</a> Sci Rep. 5, 15930 (2015).</li><li>Pethe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+screen+in+Mycobacterium+tuberculosis+identifies+carbon-source-dependent+growth+inhibitors+devoid+of+in+vivo+efficacy.">A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy.</a> Nat Commun. 1 (5), 1-8 (2010).</li><li>Diezmann, S., Michaut, M., Shapiro, R. S., Bader, G. D., Cowen, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Hsp90+Genetic+Interaction+Network+in+Candida+albicans+Reveals+Environmental+Contingency+and+Rewired+Circuitry.">Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry.</a> PLoS Genetics. 8 (3), e1002562 (2012).</li><li>Robbins, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Antifungal+Combination+Matrix+Identifies+a+Rich+Pool+of+Adjuvant+Molecules+that+Enhance+Drug+Activity+Against+Diverse+Fungal+Pathogens.">An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens.</a> Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).</li><li>Wildenhain, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+Synergism+from+Chemical-Genetic+Interactions+by+Machine+Learning.">Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning.</a> Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).</li><li>Spitzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+discovery+of+syncretic+drug+combinations+that+potentiate+the+antifungal+fluconazole.">Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole.</a> Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

מולקולה קטנה סינרגטי זוגות יכולים להיות כלי רב עוצמה לטיפול זיהומים חיידקים, אך הם לא הגיעו שלהם פוטנציאל קליני מלא כי זוגות סינרגטי מאתגרות לזיהוי. מאמר זה מתאר שיטה לזיהוי מהיר הרבה יותר פשוטה שילובים pairwise סינרגטי זוגות. באמצעות datasets כימית-גנטיקה, O2M מזהה מוטציות עם הסתרה ג'ין זה יוכל לשמ...

חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה לגרום זיהומים יותר מ-2 מיליון מקרי מוות 23,000 מדי שנה בארצות הברית על פי ה CDC1. חדש טיפולים נדרשים כדי להתגבר על זיהומים אלה. אסטרטגיות כדי לזהות טיפולים חדשים אלה כוללים הפיתוח של תרופות חדשות מיקרוביאלית או שינוי של מולקולות קטנות אישר תנאים אחרים לטיפול זיהומים חיידקים-2,-3,-4. אולם, גילוי תרופות חדשות הוא מאוד יקר וארוך. שינוי סמים לא יכול להזדהות תרופות חדישות או סמים מטרות5,6. המעבדה שלנו מתמקד אסטרטגיה שלישית המכונה שילוב סינרגיסטי טיפולים. שילוב סינרגטי להתרחש כאשר שתי מולקולות קטנות יש ביחד על יעילות יותר השפעת תוסף שלהם efficacies בודדים7. בנוסף, שילובים סינרגטי יכול להיות יעיל נגד פתוגן עמיד בפני אחד של מולקולות קטנות בזוג בנוסף פחות רצויות תופעות את המטרה, והוציאם נהדר פוטנציאליים8,9, 10.
זוגות סינרגטי הם נדירים, המתרחשים כ- 4-10% של סמים שילובים11,12,13. כך, טכניקות מסורתיות כגון מסכי pairwise הם מאתגרים וצורך, עם אלפי צירופים אפשריים של ספרייה קטנה של מולקולות מאה. יתר על כן, אינטראקציות סינרגטי בדרך כלל לא ניתן לחזות מן הפעילות של תרכובות14. עם זאת, המחברים פיתח גישה תפוקה גבוהה מסך עבור זוגות סינרגטי, קרא את החפיפה2 שיטה (O2M)12. שיטה זו, המתוארות כאן, מאפשר זיהוי מהיר יותר, יעיל יותר מכל הזוגות סינרגטי. O2M מחייב שימוש זוג סינרגטי ידוע dataset כימית-גנטיקה. כימית-גנטיקה datasets נוצרים כאשר ספרייה של knockout מוטציות גדל בנוכחות רבים מולקולות קטנות שונות. אם מולקולה אחת בזוג סינרגטי ידוע המניע את פנוטיפ זהה של מוטציה נוקאאוט מסוים כמו המולקולה סינרגטי השני, כל שאר מולקולה קטנה ולחושים של פנוטיפ של מוטציה זהה זה צריך גם שמקושרות עם כל חבר ידוע זוג סינרגטי. רציונל זה שימש במעבדה חום כדי לזהות זוגות לאנטיביוטיקה סינרגטי פעיל נגד Escherichia coli (e. coli) וזוגות תרופה נגד פטריות סינרגטי פעיל נגד הפטריה פתוגניים קריפטוקוקוס neoformans (C. neoformans)11,12. O2M הוא לא רק וישימה פתוגנים שונים, אבל מאפשר להקרנה של ספריות גדולות של מולקולות לזהות זוגות סינרגטי במהירות ובקלות. הקרנה עם המוטציה הגנטית המזוהה על-ידי O2M מאפשר לנו לאמת רק אלה מולקולות קטנות חזתה סינרגיה. לכן, בדיקות ספרייה 2,000-מולקולה של pairwise תיקח. חודשים, ואילו אם היו רק מולקולות 20 בספריה זו חזה לצוות, בדיקה של סינרגיה עכשיו לוקח עניין של ימים. O2M אינה דורשת יכולת תיכנות, הציוד הדרוש זמין ברוב מעבדות או מתקנים הליבה. בנוסף, חוקרים המעוניינים שילובים תרופתיים ניתוח O2M הוא עניין לכל אחד השלימה מסך הסמים ורוצה להרחיב את הלהיטים שלהם על-ידי זיהוי סמים חשוב-תרופתיות. להלן הוא פרוטוקול זיהוי מולקולות קטנות סינרגטי של חיידקים, כמו גם מאמת את האינטראקציות סינרגטי החזוי מבחני ידועים15,16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="520">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:179px;">Bioscreen C</td>
			<td style="width:88px;">instrument</td>
			<td style="width:136px;">Growth Curves USA</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy H1</td>
			<td>instrument</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9 broth</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J863-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Casamino Acids</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1424-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-10KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinic Acid</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12683</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiamine</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>148991000</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2 Dihydrate</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4 Heptahydrate</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chemical-genetics dataset</td>
			<td>dataset</td>
			<td>examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trimethoprim (example input drug; any can be used)</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19552701</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sulfamethoxazole (example test drug; any can be used)</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN15671125</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput identification of synergistic drug combinations by the overlap2 method

למרות סמים מיקרוביאלית הגדילו בצורה משמעותית את תוחלת החיים ואת איכות החיים בהמאה ה-20 , עמידות מיקרוביאלית מאיימת על יכולתה של החברה כולה שלנו לטיפול בדלקות מערכתית. בארצות הברית לבדה, זיהומים עמידים לאנטיביוטיקה להרוג כ- 23,000 אנשים בשנה ועלות בסביבות 20 מיליארד USD במערכת הבריאות נוספים. גישה אחת כדי להילחם עמידות מיקרוביאלית הוא טיפול משולב, אשר הוא שימושי במיוחד בשלב המוקדם קריטי של זיהום, לפני האורגניזם המזהם ופרופיל ההתנגדות שלה סמים זוהו. טיפולים מיקרוביאלית רבים להשתמש טיפולים משולבים. עם זאת, רוב אלה שילובים הם תוסף, כלומר היעילות המשולב הוא זהה לסכום היעילות לאנטיביוטיקה בודדים. כמה טיפולים משולבים הם סינרגטי: יעילות המשולבת היא הרבה יותר גדולה מאשר מוספים. שילוב סינרגטי שימושיים בעיקר כי הם יכולים לעכב את הצמיחה של זנים עמידים בפני התרופה מיקרוביאלית. עם זאת, אלה שילובים הם נדיר וקשה לזהות. זאת בשל המספר העצום של מולקולות צריך להיבדק באופן pairwise: ספריה של מולקולות 1,000 יש 1 מיליון צירופים אפשריים. לכן, נעשו מאמצים לחזות מולקולות סינרגיה. מאמר זה מתאר שיטת שלנו תפוקה גבוהה לחיזוי זוגות סינרגטי מולקולה קטנה המכונה את החפיפה2 שיטה (O2M). O2M משתמשת דפוסי מ datasets כימית-גנטית כדי לזהות מוטציות שאינן רגישות יתר כל מולקולה בזוג סינרגטי אך לא מולקולות אחרות. המעבדה חום מנצלת את ההבדל הצמיחה הזה על ידי ביצוע מסך תפוקה גבוהה עבור מולקולות כי לעכב את הצמיחה של מוטציה אבל לא פראי-סוג התאים. עבודת המעבדה זוהו בעבר מולקולות שמקושרות עם וטרימטופרים לאנטיביוטיקה את, תהליך הזיקוק של תרופה נגד פטריות באמצעות אסטרטגיה זו. . הנה, המחברים להציג שיטה למסך הרומן שילובים סינרגטי, אשר יכול להשתנות עבור מיקרואורגניזמים מרובים.

מבחני לוח שחמט הם שיטה כמותית למחצה למדידת אינטראקציות סינרגטי. הציון הסופי פלט, FICI, קובע אם שילוב סמים נחשבת סינרגטי (FICI ≤0.5), שאינו-אינטראקציה (0.5 < FICI < 4), או עוינת (FICI ≥4.0). איור 1 מדגימה כיצד להגדיר את מעברי צבע סמים ב וזמינותו לוח שחמט. איור 2</strong...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method at JoVE.com

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

שילובים תרופתיים סינרגטי הם וממושכת לזהות את הנתונים באופן אמפירי. כאן נתאר שיטת זיהוי ואימות של מולקולות קטנות סינרגטי.

זיהוי תפוקה גבוהה של שילובים תרופתיים סינרגטי בשיטת חפיפה2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

high-throughput-identification-synergistic-drug-combinations-overlap2

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

11.6K Views.  University of Utah. שילובים תרופתיים סינרגטי הם וממושכת לזהות את הנתונים באופן אמפירי. כאן נתאר שיטת זיהוי ואימות של מולקולות קטנות סינרגטי.

Video: High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

תפוקה גבוהה בידוד Assisted רובוטית של מוטאנטים קטלניים רגישים-טמפרטורה<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

דור של כרומטין יליד Immunoprecipitation רצף ספריות לניתוח צפיפות נוקלאוזום

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have been directed toward elucidation of the location and timing of initiation of genome duplication rather than its completion. However, it is critical that we understand regions of the genome that are last to complete replication, because these regions suffer elevated levels of chromosomal breakage and mutation, and they have been associated with both disease and aging. Here we describe how we have extended a technique that has been used to monitor replication initiation to instead identify those regions of the genome last to complete replication. This approach is based on a combination of flow cytometry and high throughput sequencing. Although this report focuses on the application of this technique to yeast, the approach can be used with any cells that can be sorted in a flow cytometer according to DNA content.

We describe a technique for combining flow cytometry and high throughput sequencing to identify late replicating regions of the genome.

G2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

DNA חזקים בידוד ובנייה ספריית רצף תפוקה גבוהה עבור דגימות עשבייה

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus allowing a single investigator to screen more treatments or conditions over the same amount of time without loss of data quality. The method requires common equipment found in most laboratories working with C. elegans and is thus simple to adopt. The approach centers on assaying independent samples of a population at each observation point, rather than a single sample over time as with traditional longitudinal methods. Scoring entails adding liquid to the wells of a multi-well plate, which stimulates C. elegans to move and facilitates quantifying changes in healthspan. Other major benefits of the Replica Set method include reduced exposure of agar surfaces to airborne contaminants (e.g. mold or fungus), minimal handling of animals, and robustness to sporadic mis-scoring (such as calling an animal as dead when it is still alive). To appropriately analyze and visualize the data from a Replica Set style experiment, a custom software tool was also developed. Current capabilities of the software include plotting of survival curves for both Replica Set and traditional (Kaplan-Meier) experiments, as well as statistical analysis for Replica Set. The protocols provided here describe the traditional experimental approach and the Replica Set method, as well as an overview of the corresponding data analysis.

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Here we describe the Replica Set method, an approach to quantitatively measure C. elegans lifespan/survival and healthspan in a high-throughput and robust manner, thus allowing screening of many conditions without sacrificing data quality. This protocol details the strategy and provides a software tool for analysis of Replica Set data.

השיטה קבע עותק משוכפל: בגישה תפוקה גבוהה באופן כמותי מידה Caenorhabditis elegans תוחלת החיים

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT employs two purification steps. First, immunoprecipitation of a tagged RNP subunit is followed by mild RNase digestion and subsequent non-denaturing affinity elution. A second immunoprecipitation of another RNP subunit allows for enrichment of a defined complex. Following a denaturing elution of RNAs and proteins, the RNA footprints are converted into high-throughput DNA sequencing libraries. Unlike the more popular ultraviolet (UV) crosslinking followed by immunoprecipitation (CLIP) approach to enrich RBP binding sites, RIPiT is UV-crosslinking independent. Hence RIPiT can be applied to numerous proteins present in the RNA interactome and beyond that are essential to RNA regulation but do not directly contact the RNA or UV-crosslink poorly to RNA. The two purification steps in RIPiT provide an additional advantage of identifying binding sites where a protein of interest acts in partnership with another cofactor. The double purification strategy also serves to enhance signal by limiting background. Here, we provide a step-wise procedure to perform RIPiT and to generate high-throughput sequencing libraries from isolated RNA footprints. We also outline RIPiT&#39;s advantages and applications and discuss some of its limitations.

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Here, we present a protocol to enrich endogenous RNA binding sites or &#34;footprints&#34;&#160;of RNA:protein (RNP) complexes from mammalian cells. This approach involves two immunoprecipitations of RNP subunits and is therefore dubbed RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT).

זיהוי של טביעות רגליים של RNA: מכלולי חלבון באמצעות RNA Immunoprecipitation בטנדם ואחריו רצף (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

זיהוי תפוקה גבוהה של שילובים תרופתיים סינרגטי בשיטת חפיפה²

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video