מערכת אורגנואידית צינור מרה חוץ-פתולוגית זו יכולה לטפל בגישה המוגבלת למודלים של כולנגיופתיות פרה-קליניות ולמגבלות של תאי גזע פלוריפוטנטיים ומודלים אורגנואידים של צ'ולנגיוציטה שמקורם בכבד. המודל שלנו הוא ספציפי לרקמות למבוגרים, רדוקציוניסטי, ניתן לשחזור, ותזמן וחסכוני. זה יהיה לתועלת מיוחדת למעבדות כי אין גישה לרקמות אנושיות.
הטכניקה שלנו מאפשרת culturing של מספר כמעט בלתי מוגבל של cholangiocytes צינור המרה extrahepatic ללמוד התחדשות רקמות אינטראקציות תא לתא. הפגנת ההליך תהיה ג'וניה שיוטה, פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי. לבידוד צינור המרה ההפוכות, מניחים את העכבר הבוגר בתווית על-חושית ופתיחת חלל הבטן לאורך קו האמצע.
יש לחזור בכבד כדי לנוח על הסרעפת ולהשתמש בהמוסטט כדי למשוך בעדינות את התריסום הפרוקסימלי כדי לחשוף את צינור המרה הנפוץ מיד מתחת לעצם הכבד. השתמש אזמל כדי להפריד את צינור המרה extrahepatic מן הרקמות שמסביב. מחזיק את הקצה הפרוקסימלי של צינור המרה המשותף עם מלקחיים, לנתח את הצינור distally ממש מעל הצומת שלה עם התריסיון לפני לנתח את הקצה הפרוקסימלי של הצינור מהכבד.
מיד מניחים את צינור המרה החוץ-עורי המבודד לתוך צלחת זכוכית המכילה חיץ כביסה קר על קרח, ולאחר מכן לנקות את צינור המרה מן הרקמה שמסביב טחון לתוך 0.5 מילימטר חלקים. כאשר כל הרקמה כבר טחון, להעביר את החלקים לתוך צינור המכיל 500 microliters של חיץ דיסוציאציה עבור דגירה של 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדיסוציאציה, לנטרל את החיץ עם 500 microliters של תאים קרים כקרח תרבות בינונית triturate השעיית הרקמה 20 פעמים דרך מחט 18 מד ולאחר מכן 20 פעמים דרך מחט 20 מד.
ואז לסנן את ההשעיה התא וכתוצאה מכך דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור 50 מיליליטר. כדי להקים תרבות אורגנואידית מרה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה בזהירות להסיר את supernatant. תבזבזו מחדש את גלולת גלולה במיליליטר אחד של PBS קר כקרח, סטרילי ולהעביר את התאים לצינור 1.5 מיליליטר עבור צנטריפוגה שנייה.
תן שוב את גלולת שטף ב 120 microliters של מטריצת מרתף נזילות, קר כקרח צלחת 40 microliters של תאים למרכז של כל שלוש בארות של 37 מעלות צלזיוס מחומם, צלחת 24 היטב, ולאחר מכן למקם את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס רקמת תרבות החממה במשך כ 15 דקות. כאשר מטריצת המרתף התגבשה, מוסיפים 600 מיקרוליטרים של 37 מעלות צלזיוס זורעים בינוניים לכל באר לפני שמחזירים את הצלחת לאנקובטור. לאחר שלושה ימים וכל שלושה ימים לאחר מכן, החלף את מדיום הזריעה ב-600 מיקרוליטרים של מדיום תרבות אורגנואידית טרייה, וניטור צמיחת האורגנואידים באופן קבוע במיקרוסקופ הפוך.
כדי לעבור את תרבות צינור המרה יוצאות התכלית, פיפטה האורגנואידים בכל באר עם 400 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח 10 פעמים ל הבאר לפני העברת תכולת הבאר לצינורות בודדים של 1.5 מיליליטר. מעבר כל תערובת דרך מחט 25-מד ארבע פעמים כדי לנתק את האורגנואידים ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן בצע שימוש חוזר בתאים במטריצת המרתף ביחס המתאים ל ציפוי מחדש.
לאחסון ארוך טווח של צינור מרה חוץ-פתיל, יש לשטוף כל באר של אורגנואידים עם PBS בטמפרטורת החדר מבלי להפריע למטריצת המרתף ולהוסיף 500 מיקרוליטרים של מדיום מקפיא קר כקרח לכל באר. יש לעכל בעדינות את האורגנואידים ולהעביר את התערובת לבקבוקונים קריוגניים בודדים, ולאחר מכן מניחים את הבקבוקונים במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לפני העברת האורגנואידים למיכל חנקן לאחסון ארוך טווח בשלב האדים. כדי להכין את האורגנואידים להטמיע פרפין, החלף את המדיום ב-500 מיקרוליטרים של ארבע מעלות צלזיוס PBS והעבר את המתלים מכל באר לצינורות בודדים של 1.5 מיליליטר המכילים מטריצת מרתף נזילות.
לאסוף את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ולהשתמש קצה פיפטה P1000 שונה כדי להסיר בזהירות את supernatants מבלי להפריע כדורי. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של קרח קר, 4% paraformaldehyde לאורגנואידים עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, החלף את התיקון עם מיליליטר אחד של טמפרטורת החדר PBS עבור דגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה שלוש פעמים.
לאחר הכביסה האחרונה, יש להתרכך באורגנואידים במיליליטר אחד של 30% אתנול עבור דגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגירה של חמש דקות במיליליטר אחד של 70% אתנול בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה 70%אתנול, לאסוף את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה resuspend האורגנואידים במיליליטר אחד של 100% אתנול במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה 100%אתנול, דגימת חום עיבוד ג'ל במיקרוגל במשך 20 שניות או עד נזול, ולהוסיף 50 microliters של ג'ל נזול לכל צינור של אורגנואידים.
מניחים את הצינורות על קרח עד שג'ל עיבוד הדגימה מתמצק ומעבירים את טיפת האורגנואידים מכל צינור בין רפידות הספוג הכחולות בקלטת לעיבוד נוסף בהטבעת הפרפין. מניחים את הקלטת במעבד רקמות מתוכנת במשך 15 דקות לכל צעד, ולאחר מכן לקטע את האורגנואידים מוטבע פרפין בג'ל עיבוד דגימה בארבעה מיקרומטרים לכל קטע עבור כתמים אימונוהיסטוכימיים וניתוח על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. יעילות ציפוי צינור המרה יוצאת הרפאים היא כ-2% כאשר היא מבודדת מעכברים יילודים או מעכברים בוגרים.
לאחר מעבר שני, יעילות ציפוי של אורגנואידים צינור מרה extrahepatic נגזר עכברים בוגרים עולה ל 11%ונשאר יציב. רוב האורגנואידים מדגימים מורפולוגיה ציסטיק לאורך כל המעברים עם אורגנואידים לא סדירים נדירים. האורגנואידים מגיעים לשיא צמיחה של חמישה עד שבעה ימים, ולאחר מכן הם מתחילים לצבור פסולת תוך-אלומיניום ומתדרדרים.
לכן, לשמירה על תרבות האורגנואידים, יש לפצל את האורגנואידים כל שבעה עד עשרה ימים. כאשר מנותחים עם immunofluorescence, אורגנואידים צינור מרה extrahepatic מורכב מאוכלוסייה טהורה של תאי אפיתל מסומן על ידי E-cadherin. תאים אורגנואידיים גם להדגים סמנים של תאים מולדים המרה, כמו גם סמנים של בידול המרה.
חשוב לציין, אחוז גבוה של תאים אורגנואידים יש סיליום ראשוני מסומן על ידי אצטילאט אלפא Tubulin, שהוא תכונה של cholangiocytes נורמלי ומציע קיטוב תא אורגנואיד מתאים. נדרשת הקפדה צמודה על תנאי הטמפרטורה המתוארים. ניתוח צינור המרה המוקפד מונע זיהום בתאי הלבלב.
אובדן של חומר הסלולר ניתן להימנע על ידי מניפולציה זהירה לאחר צנטריפוגה. אורגנואידים אלה יכולים לשמש מודלים פרה-קליניים, גנטית ופרמקולוגית מניפולציה, או משמש לבדיקת תרופות ואת ההשפעות של סוכנים זיהומיות. שיטה זו יכולה לשמש מעבדות שרוצות לנצל מודלים עכבר מהונדסים גנטית כדי להמשיך לחקור את המנגנונים של ביולוגיה cholangiocyte.
