שיטה זו מתאימה את פרוטוקול התרבות המטא-טארסלית לעצמות גדולות יותר, ומאפשרת שילוב של מניפולציה ישירה בעצמות עם מודלים גנטיים מורכבים לטיפול בתהליכים הקשורים להתפתחות העצם. טכניקה זו מאפשרת מניפולציה וניתוח של צמיחת העצם כי אינם אפשריים ב vivo, כגון הדמיה חיה או מניפולציה פיזית ופרמקולוגית ישירה. שיטת תרבות אקס ויוו זו מאפשרת מחקר ספציפי של ההשפעות המקומיות של ההתפרצות הגנטית בעצם המפרידה אותה מההשפעה המערכתית שיש לטיפול על האורגניזם.
התחל על ידי עיקור אזור הבטן של יום הריון בהריון 14.5 כדי 18.5 עכבר עם 80% אתנול ושימוש מספריים קטנים כדי לפתוח את העור ואת שרירי הבטן כדי לגשת קרני הרחם. כדי לחלץ את הרחם מחלל הבטן, להסיר את mesometrium לחתוך את הבסיס של הקרניים. לאחר מכן, מעבירים את הרחם לצלחת פטרי 60 מ"מ המכילה מדיום ניתוח קר כקרח על קרח.
ב ארון biosafety לחתוך בין השקים עם מספריים כדי להפריד את העוברים בודדים, ולהעביר שק בודדים לתוך צלחת חדשה 60 מילימטר עם מדיום ניתוח טרי תחת מיקרוסקופ סטריאו ניתוח. השתמש פינצטה כדי להפריד את העוברים מן שליה כדי לנקות את העוברים מן הממברנות. השתמש פיפטה פלסטיק גזוז להעביר את הגוף לתוך צלחת חדשה 60 מילימטר, לערוף את העובר לפני ניתוח נוסף.
לאחר מכן השתמש פינצטה כדי להסיר את העור, החל מאחור מתקלף אל בהונות. השתמש פינצטה לחתוך קרוב לעמוד השדרה ולהפריד את הגפיים האחוריות מהגוף. מעבירים את הגפיים האחוריות לצלחת נקייה המכילה מדיום ניתוח קר כקרח, ומכניסים את פינצטה בין סחוס פני השטח של עצם הירך הדיסטלית לבין השוקה הפרוקסימלית כדי להפריד את השוקה מעצם הירך.
מוציאים את עצמות הירך מעצם הירך הפרוקסימלית ועצם הקלקניוס והבולבולה מה השוקה. בזהירות לקטוע ולמשוך את הרקמות הרכות מן הירך ואת השוקה ולהשתמש פיפטה סטרילי אחד מיליליטר להעביר את כל ארבע עצמות הרגל לתוך הבאר הראשונה של צלחת 24 היטב המכיל מדיום ניתוח טרי. חשוב להראות כי הרקמה הרכה שמחברת את הדופק של העצם מוסרת.
אחרת, העצם תתכופף ולא תשיג צמיחה נאותה. כאשר העצמות נותאו ממספרם הניסיוני המתאים של העוברים, תדמיינו את העצמות בכל באר לפעמים אפס תחת מיקרוסקופ אור עם ניגודיות טובה והחליפו את מדיום הניתוח בכל באר במיליליטר אחד של מדיום תרבותי למטר תוך נקיטת זהירות נוספת שלא לקדם את העצמות. כדי לבחון את ההשפעה של עיכוב צמיחה בתנאי התרבות, לטפל השוקה השמאלית עם 500 חומצה רטינואית nanomolar ו דגירה השוקיים הימניים עם נפח שווה ערך של הרכב כבקרה.
לאחר מכן, מניחים את הצלחת באינקובטור של תרבות התאים בתנאי תרבות תאים סטנדרטיים. לאחר יומיים, לטפל בעצמות עם אנלוגי תימידין מתאים במשך שעה עד שעתיים כדי להעריך את התפשטות תאי העצם לפני העברת העצמות לצינורות בודדים שני מיליליטר של 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות. לאחר מכן, להעביר את העצמות PBS כדי לדמיין את העצמות בנקודת הזמן האחרונה לפני החזרת הדגימות paraformaldehyde עבור קיבעון לילה בארבע מעלות צלזיוס.
כדי למדוד את האורך ואת האזור המינרלי של העצמות, לפתוח תוכנת הדמיה מתאימה, ולקחת בחשבון את קנה המידה של התמונה, למדוד הן את האורך הכולל של העצם, ואת האזור מינרלים. התחלת המידות מהתאים הכהים הראשונים בקצה אחד עד לתאים הכהים האחרונים בקצה השני. כדי לחשב את קצב הגדילה המוגדר כעלייה הממוצעת באורך ליום, חלק את ההפרש בין האורך הסופי של העצם לבין האורך הראשוני במספר הימים בתרבות.
כאן מוצגת השוואה בין השוקה התרבותית לבין השוקה הטרייה המופקת בשלבים מקבילים. לאחר עד יומיים של תרבות, הגודל שהושג דומה לצמיחת העצם in vivo הן עבור הסחוס והן עבור עצם מינרלית. תקופות תרבות ארוכות יותר מובילות להבדלים גדולים יותר בין העצמות התרבותיות לבין העצמות שחולצו זה השנה.
הערה, השוקה גדל עם הסרה מלאה של הרקמה הרכה יכול לגרום כיפוף של השוקה התרבותית. לטיפול בחומצה רטינואית יש השפעה חזקה על הצמיחה הטיביאלית כבר לאחר יומיים של טיפול. למרות שיש עלייה עקבית באורך הכולל של השוקה לאחר יומיים בתרבות, צמיחה זו תואמת לעלייה משוערת של תשעה עד 29% בלבד מהאורך הראשוני.
פחות מצמיחת העצם כי יהיה נצפתה vivo. אכן, תיוג אנלוגי תימידין מראה פחות תאים חיוביים באזור זה לאחר התרבות לעומת עצמות שחולצו טריות של שלב שווה ערך. יתר על כן, בטיביה תרבותית במבחנה, האורך הכולל של אלמנט השלד עולה באופן משמעותי, בעוד כמעט ללא עלייה באזור מינרלים הוא ציין.
בנוסף לניתוח היסטולוגי ומולקולרי, ניתן לבצע ניקוי והדמיה תלת מימדית לאחר התרבות כדי לאפיין את ההשפעה התאית של הטיפולים המוחלים על העצמות המתורתות. הטכניקה מאפשרת לנו להתייחס לשאלות הקשורות לתקשורת בין-אורגנית. לדוגמה, על ידי שיתוף culturing עצמות מן המודלים הגנטיים השונים בסוג כלשהו של ניסוי פרביוזיס ללא כאבים.
