סינתזת חלבונים נוטה לטעויות. עם זאת, שגיאות עשויות להיות אדפטיביות תחת לחץ פיזיולוגי. הוכחנו בעבר ששגיאות תרגום ספציפיות במיקובקטריום תורמות לסובלנות אנטיביוטית.
היכולת למדוד שיעורי שגיאה ספציפיים מאפשרת לנו למקד את המנגנון הזה של הסתגלות חיידקים. היתרונות העיקריים של טכניקות אלה הם רווח של כתבים פונקציה יכול להיות רגיש להפליא במדידת שיעורי שגיאה קטנים שאינם קלים לגילוי על ידי ספקטרומטריית מסה. מבדיקה Nluc / GFP מאפשר הקרנת תפוקה בינונית שכן הוא נמנע טיפול מוגזם תזה של החיידקים.
הדגמת ההליך תהיה דוקטורנט יואה-מנג צ'ן. היום נדגים את הנוהל של שימוש בשני הכתבים האלה דרך הסרטון הזה. כדי להתחיל, לחסן שני מיליליטר של מדיום 7H9 עם סוג פראי מוטציה זני כתב mycobacterial.
לנער ב 37 מעלות צלזיוס במשך יום עד יומיים או עד OD ב 600 ננומטר מגיע לשלב נייח. Aliquot ולדלל כדי לקבל OD ב 600 ננומטר סביב 0.5 כדי 1. לאחר מכן, להוסיף ATC לריכוז סופי של 50 ננוגרם למיליליטר.
מיד להוסיף מינונים שונים של ksg לתרבות על פי כתב היד כדי למדוד את השפעותיו על שיעורי בטעות. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות במשך ארבע עד שש שעות. לאחר מכן, להעביר את תרבות החיידקים לצינור שני מיליליטר.
וצנטריפוגה ב 3, 220 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כדי גלולה למטה החיידקים. לאחר שלב הצנטריפוגה, השלך את העל-טבעי ושבש את החיידקים על-ידי הוספת 40 מיקרוליטרים של חיץ תמוגה פסיבי פי 1. מעבירים את החיידק המתודלק מחדש לצלחת לבנה של 96 בארות, באר אחת לכל דגימה, ומנערים בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
מוסיפים 80 מיקרוליטרים של מצע גחלילית לכל באר. לנער במשך 15 שניות ולמדוד את הזוהר על ידי לומינומטר. לאחר מכן, להוסיף 80 microliters של מצע רנילה לכל באר.
לנער במשך 15 שניות ולמדוד את הזוהר על ידי luminometer. השתמש בערכים מתוקנים כדי לחשב את שיעורי העריכה שגויה של כל תנאי. כדי להתחיל, לחסן שני מיליליטר של מדיום 7H9 עם זן הכתב חיידקי.
לנער ב 37 מעלות צלזיוס במשך יום עד יומיים או עד OD ב 600 ננומטר מגיע לשלב נייח. לאחר מכן, תת תרבות ב 50 מיליליטר של מדיום 7H9 לגדול עד OD ב 600 ננומטר מגיע לשלב נייח מאוחר. לפני aliquoting את החיידקים לצלחת 96-well, מוסיפים ATC בריכוז סופי של 50 ננוגרם למיליליטר ומערבבים היטב.
הוסיפו 100 מיקרוליטרים ל הבאר לצלחת ברורה עם תחתית עגולה של 96 בארות. לאחר מכן, להוסיף מינונים שונים של ksg ל בארות נבחרות כדי לסנן את השפעותיו על שיעורי mistranslation. מוסיפים 200 מיקרוליטרים של מים סטריליים לקורות של הצלחת כדי להגביל את האידוי מ בארות הדגימה.
לאטום את הצלחת, לנער, ולעורר את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 עד 20 שעות. השתמש פיפטה רב ערוצית לקחת 80 microliters מכל באר. מעבירים את הדגימות לצלחת 96 באר עם תחתית שחורה ומודדים את אות ה-GFP לפי מד הזוהר.
לאחר מדידת אות GFP, צנטריפוגה הצלחת ב 3, 220 פעמים גרם במשך 10 דקות. לאחר מכן, להעביר 50 microliters של supernatant לצלחת לבן תחתית 96 היטב. לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של מצע Nluc לכל באר.
מערבבים היטב ומודדים את הזוהר לפי הלומינומטר. לבסוף, לקבוע את יחס Nluc / GFP על ידי חלוקת ערך זוהר Nluc מתוקן על ידי פלואורסצנטיות GFP. בעבודה זו, מערכת כתב גחלילית רנילה שימש כדי למדוד את שיעור בטעות בנוכחות kasugamycin ב סוג פראי בזן של S.Smegmatis אשר ksgA נמחק.
התוצאות הראו אופן ברור תלוי מינון של ksg הפחתת שיעור mistranslation בעוד בזן המחיקה ksgA, ksg היה פחות חזק ואת הבסיס של שיעור mistranslation היה גבוה יותר בשל ההתנגדות אפנון על ידי kasugamycin. פעולת Kasugamycin על לשון הרע נמדדה גם באמצעות כתב Nluc / GFP. גם רנילה פיירפליי וגם כתב Nluc / GFP כרוכים במדידת פעילות לוציפראז.
שגיאות צינורות קטנות עלולות לגרום לתנודות גדולות בהקראות. בתור התחלה, אנו ממליצים להגדיל את מספר השכפולים של כל אחד מהם כדי למזער את הסיכוי לקבל נתונים לא מהימנים.
