באמצעות פרוטוקול זה, אנו יכולים בקלות לייצר לא מעט פלבנולים מ flavanones בסיר אחד. טכניקה זו היא חיסכון בעבודה ובזמן, חסכונית מאוד וקלה לשליטה, כך שיש לה פוטנציאל תיעוש עצום. כן, שיטה זו יכולה לספק תובנה על הייצור הכלכלי של מטבוליטים משניים אחרים, אבל זה צריך כמה שינויים כאשר מוחל על זה.
הוא בדרך כלל לא יקבל כלום או תשואה נמוכה מאוד. העצה שלי היא לטפל באנזימים רקומביננטיים על קרח ולהוסיף 10% גליצרין לפתרון המלאי של אנזימים. זאת משום שרק באמצעות הדגמה חזותית יכולה יד חדשה להבין את הפרטים החשובים ואת האמת המשפיעים על הביצוע המוצלח של הניסוי.
ראשית להכין מאגרים. הפוך פעמיים חיץ סינתטי על ידי המסת כמות מתאימה של TRIS בסיס, אסקורבט נתרן, חומצה אלפא ketoglutaric לתוך מים מיונים דה, ואת כמות מתאימה פיפטה של גליצרול לפתרון. השתמש פיפטה כדי להוסיף חומצה הידרוכלורית כדי להתאים את ה- pH ל 7.2, ולהתאים את עוצמת הקול על ידי הוספת מים מיוננת.
אחסן את המאגר הסינטטי פעמיים בארבע מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. ואז לעשות פתרון מלאי 100 פעמים על ידי המסת heptahydrate ברזלי גופרית במים deionized. הפוך פתרון מלאי של פלבנואיד 25 מילימולארי על ידי המסת פלבנואיד במתנול, ולאחסן את הפתרון במינוס 20 מעלות צלזיוס.
הצעד הקריטי ביותר הוא להקים מערכת סינתטית. כדי להקים מערכת סינתטית כדי לייצר flavanol מ flavanone, תחילה להכין את המערכת הסינתטית בצינור שני מיליליטר על פי reagents המפורטים בטבלה זו. מניחים את הצינור הפתוח בבלוק חום רועד ב 40 מעלות צלזיוס, ב 600 סל"ד במשך ארבעים דקות.
לאחר מכן, לסיים את התגובה על ידי הוספת 10 microliters של חומצה אצטית, ו 100 microliters של אתיל אצטט. שעתיים לאחר מכן, השתמשו בפיגט כדי להפוך את השלב האורגני העליון לצינור של 1.5 מיליליטר, והם מניחים את הצינור במכסה המנוע לייבוש אוויר בטמפרטורת החדר. כדי לבצע ניתוח TLC, לאחזר תחילה את הצינורות מהמכסה המנוע, ולהמיס מחדש את אבקת flavanoid ב 160 microliters של מתנול בצינור.
הכן דגימות פלבנואיד אותנטי עם ריכוזים סדרתיים, על ידי דילול 25 מילימולר פלבנואיד פתרון מלאי מתנול. טען מיקרוליטר אחד של דגימת התגובה המופתרת מחדש, ומיקרוליטר אחד של דגימת הפלבנואידים האותנטית, על לוח פוליאמיד. לעשות את אותו הדבר עבור ריכוזים אחרים של פלבנואיד אותנטי על אותה צלחת.
ואז במכסה המנוע אדים, לשים את צלחת טעון מדגם בצילינדר כרומטוגרפיה מלא במערכת ממס. חבר את הצלחת לתחתית הצילינדר, והפעל את הצלחת במערכת הממס במשך 20 דקות. האוויר מייבש את הצלחות בטמפרטורת החדר.
עם בקבוק מרסס, לרסס את הצלחות עם 1% פתרון אתנול של אלומיניום כלורי, ואחריו אוויר ייבוש שוב בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לדמיין את הכתמים על הלוחות תחת אור UV ב 254 ננומטר, ולצלם, ולאחר מכן במחשב, לפתוח את התוכנה ImageJ. לחץ על קובץ, פתח, כדי לפתוח את התמונה שיש לנתח.
לחצו על כלי הבחירה המלבני השמאלי ביותר בממשק המשתמש ImageJ. מיתאר את ה- ROI בתמונה באמצעות העכבר והקש על אחד מהם כדי להוסיף תווית ל- ROI הראשון. הזז את הבחירה המלבנית עם העכבר ימינה להזזה הבאה, והקש על שתיים כדי להוסיף תווית ל- ROI השני.
חזור על הפעולה כדי לתייג את כל תווי ההשקעה האחרים על-ידי הקשה על שניים. הקש שלוש כדי ליצור התוויות פרופיל עבור כל תווי ההשקעה, בחלון מוקפץ. לאחר מכן, השתמש בכלי בחירת הקו הישר כדי להוריד תוכניות בסיסיות כדי להגדיר אזור סגור עבור כל שיא של עניין.
הפעל את כלי השרביט, על-ידי לחיצה על הסמל המתאים בממשק המשתמש של ImageJ. לחץ בתוך השיא כדי להציג תוצאות עבור כל הפסגות בחלון מוקפץ. לאחר מכן, ב- Excel, התווה את הערכים האפורים מהחלון המוקפץ כנגד ריכוזי הפלבנואידים המתאימים, כדי ליצור עקומה סטנדרטית מבוססת TLC של הפלבנואיד האותנטי.
לאחר מכן לחשב את התשואה של פלבנואיד של ריבית המיוצר בפרוטוקול זה, על פי הנוסחה וכתוצאה מכך. השתמש במזרק כדי לעבד כל דגימה ברצף באמצעות מסנני מיקרומטר ו- 0.22 מיקרומטר. טען את הדגימות למערכת HPLC-MS באמצעות חריר יניקה והפרד את הדגימות ב- 30 מעלות צלזיוס באמצעות עמודת C18.
אלר את העמודה במיליליטר אחד לדקה על ידי שיפוע של 10 עד 85 נפח אחוז אצטיל ניטריל במים, ולפקח על ספיגת ההתרומםות מ 200 עד 800 ננומטר. בצע את ניתוח LC-MS במצב יון שלילי, עם זרימת חנקן ייבוש של 10 ליטר לדקה ב 300 מעלות צלזיוס, בזרימת גז נדן של שבעה ליטר לדקה ב 250 מעלות צלזיוס, ולאסוף נתונים באמצעות תוכנה מובנית. כדי לחלץ כרומטוגרפים באורך גל יחיד, פתח את תוכנית הניתוח האיכותי ולחץ על קובץ, פתח קובץ נתונים.
בחר את הקובץ שיש לנתח בחלון קובץ הנתונים הפתוח ולחץ על פתח כדי לפתוח את הקובץ. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני בחלון תוצאות הכרומטוגרמה ולאחר מכן חלץ כרומטוגרמות בתפריט נפתח. ברשימת הסוגים, לחץ על כרומטוגרמות אחרות.
בתיבה המשולבת של הגלאי, בחר DAD1 ולאחר מכן לחץ על אישור כדי להציג את תוצאות HPLC בחלון תוצאות הכרומטוגרמה. לחץ על סמל השילוב הידני שעגן בחלק העליון של חלון תוצאות הכרומטוגרמה. צייר קו בסיס עבור השיא הנדרש לניתוח שילוב ידני עם העכבר.
לחץ על תצוגה, רשימת שיא שילוב, כדי להציג את התוצאות. העתק את התוצאות של אזורי השיא ל- Excel, והתוות עקומה סטנדרטית מבוססת HPLC של הפלבנואיד האותנטי כנגד ריכוזי הפלבנואידים המתאימים, ולאחר מכן חשב את התשואה של פלבנואיד העניין המיוצר בפרוטוקול זה בהתאם לנוסחה המתקבלת. ואז לחזור על אותם הליכים כדי לחלץ כרומטוגרמות באורך גל יחיד כדי לנתח את נתוני MS עבור המסה המדויקת של תרכובות פלבנואידים.
לחץ על סמל בחירת הטווח בסרגל הכלים של תוצאות הכרומטוגרמה. בחר את שיא העניין. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני בטווח הנבחר ולחץ על ספקטרום החילוץ MS בתפריט הנפתח כדי להציג את התוצאות בחלון תוצאות ספקטרום MS.
כדי לקבוע אם מערכת זו במבחנה ניתן להשתמש עבור המרה של flavanone לתוך פלבנול, NRN נוסף לתוך המערכת. היו שני כתמים חדשים הופיעו על צלחת TLC פוליאמיד. נקודה אחת הראתה מרחק הגירה דומה לזה של DHK, והאחרים דומים לזה של KMF.
ניתוח נוסף של HPLC ו- LC-MS הראה כי הכימיקל החדש הראה זמן שמירה של 12 דקות ו -20 דקות בהתאמה, בשיא יון מעין מולקולרי M מעל Z ב 287 ו 285 שהיו זהים לאלה של DHK ו KMF. כדי לקבוע אם המערכת יכולה לשמש להמרה של flavanones אחרים לתוך פלבנולים המתאימים שלהם, ERD נוספה לתוך המערכת. שני כתמים חדשים על לוח TLC פוליאמיד הציג מרחק הגירה דומה לזה של DHQ ו QRC בהתאמה.
ניתוחי HPLC ו- LC-MS הראו כי כימיקלים חדשים אלה חשפו זמן שמירה של 10 דקות ו -16 דקות בהתאמה, ושיא יון מעין מולקולרי M מעל Z ב 303 ו - 301, אשר התאים בדיוק לאלה של DHQ ו- QRC. בעת הכנת המערכת הסינתטית, אתה צריך להוסיף את האנזים לבסוף, ולהוסיף את sulfate ברזלי השני אחרון. כן, הוא מספק מדריך לייצור חסכוני של מטבוליטים משניים אחרים.
