כיום, immunohistochemistry משמש בתדירות הולכת וגוברת כדי לזהות את נוכחותם של סמנים מולקולריים ספציפיים ואת השינויים שלהם במקרה של פתולוגיות, נותן שורש לאפשרות לבצע ניתוח כמותי. אימונוהיסטוכימיה, בעיקר טכניקת immunofluorescence, משמשת בזחל ובמודל החיה של דג הזברה הבוגר, אך מעט מאוד ידוע על פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה סטנדרטי טוב עבור דגי זברה. כאן אנו מתארים וממחישים פרוטוקול שניתן להשתמש בו כדי לחקור את השימור האבולוציוני של חלבונים חשובים בזברה-דגי זברה בוגרים.
פרוטוקול טוב לאימונוהיסטוכימיה בדג זברה בוגר יכול לעזור ביסוד התועלת של מודל זה של בעלי חיים כדי לחקור את הביטוי המורפולוגי ואת ההפצה של ביומולקולות שמורות מאוד. שיטה זו יכולה גם לעזור לנתח שינויים אפשריים של ביומולקולס אלה עקב תנאים פתולוגיים בקורלציה לפיזיולוגיה האנושית. הדגימה של ההליך תהיה ד"ר לאה טוניסי, דוקטורנטית מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל בהליך זה, להעביר את בלוקים רקמה קפואה מוכן קריוסטט במינוס 20 מעלות צלזיוס. חותכים את הבלוק בחלקים קורונטל או קשת של 10 מיקרומטר. לאחר מכן, לאסוף את הרקמות בחלקים סדרתיים חלופיים על מגלשות זכוכית דבק מתאים immunohistochemistry, ולאחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס עד מוכן להמשיך.
ראשית, השתמש בעט עמיד בממס כדי לתאר את אזור הרקמה בשקופית. שוטפים את החלקים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד באמצעות חיץ פוספט 0.1 טוחן. לאחר מכן, יש להמיס 0.3 מיליליטר של טריטון X-100 ב-100 מיליליטר של מאגר פוספט 0.1 טוחן כדי להכין את טריטון X-100 0.3%, להמיס 0.1% סרום חמור רגיל במאגר פוספט המכיל 0.3% טריטון X-100 להכנת פתרון החסימה.
הדגירה את החלקים עם הפתרון של סרום חמור נורמלי מומס חיץ permeabilization PB-טריטון X-100 0.3% במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחלחל קרום התא ולחסום את אתרי הכריכה שאינם ספציפיים. ראשית, לשטוף את החלקים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם חיץ פוספט 0.1-טוחן. מוסיפים את תערובת הנוגדנים הראשוניים המדוללים ב- PB-T, ומדגרים את החלקים לילה בקופסה לחה בטמפרטורת החדר.
ביום שאחרי, לשטוף את החלקים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם חיץ פוספט 0.1-טוחן. חלקי דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים בתערובת מתאימה של נוגדנים משניים מדולל PB-T. כדי להתחיל, לשטוף את החלקים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם חיץ פוספט 0.1-טוחן.
להמיס 1.5 microliters של DAPI בשלושה מיליליטר של מאגר פוספט כדי להכין את DAPI צבע גרעיני. תנטרל את החלקים בצבע. לאחר מכן, השתמש במדיום הרכבה כדי מכסה את השקופיות כדי לייצב את הרקמה ואת הכתם לשימוש ארוך טווח.
דגימות פלואורסצנטיות ניתן לאחסן בחושך בארבע מעלות צלזיוס. חזור על פרוטוקול immunofluorescence, וגם להשמיט את הנוגדן העיקרי או המשני, או להחליף את הנוגדן העיקרי או המשני עם מאגר פוספט כדי להכין את השליטה השלילית. לאחר מכן, חזרו על פרוטוקול הכשל החיסוני וספגו מראש כל נוגדן ראשוני עם עודף של הפפטיד היחסי.
חזור על פרוטוקול immunofluorescence על פרוסות של מוח העכבר כדי להכין את השליטה החיובית. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בשלב ממונע X-Y-Z, מצלמה דיגיטלית, ותוצר רכישה וניתוח, להתבונן ולנתח את החלקים הכשלים במערכת החיסון. להשיג תמונות דיגיטליות עם 5x, 20x, ו 40x מטרות.
לצלם תמונות של כל מקטע בהגדלה נמוכה בכל אחד מהערוצים הזמינים כדי להלחין מונטאז' בהגדלה נמוכה. מנרמלים את תמונות הפלואורסצנטיות לניגודיות ולשכבות-על מרביות. בכל תחום העניין, לאסוף סידורי Z-ערימות של תמונות דרך שישה מישורים מוקד עם מדרגות מוקד של אחד עד 1.8 מיקרומטר.
בצע אוסף זה עבור כל ערוץ בנפרד. לאחר מכן, השתמש בתוכנת דימות deconvolution כדי deconvolvolve תמונות על ידי יישום של 10 איטראציות, ול לכווץ את התמונות טוריות במישור Z לתוך תמונת הקרנה מקסימלית אחת. השתמש בתוכנה מתאימה לעריכת תמונות כדי לכוונן את המיקרוגרפים לאור וניגודיות.
ניתוח אימונוהיסטוכימי של התפלגות OX-A ו- OX-2R במעיים של דגי זברה בוגרים מראה אתרי לוקליזציה שונים של OX-A ו- OX-2R ועליות הביטוי שלהם בתאי המעי של דגי זברה של DIO. כתמים חומים עזים עבור OX-A נצפתה בתאי המעי המדיאלי והתורי. הדיכוי החיסוני של OX-A נותן אותות ברורים בתאי המעיים השונים, פוחת מהקם הקדמי לכיוון המעי המדיאלי.
תוצאות דומות נצפו עבור OX-2R immunoexpression במעי של DIO ושליטה דיאטה זברה. אות OX-A מוגבר בדג זברה למבוגרים DIO מלווה בלחץ יתר של OX-2R בתאי מעיים אחרים. ניתוח מדויק של תמונות immunofluorescent מראה את הגידול של OX-2R / CB1R colocalization במעיים של דג זברה בוגר DIO בהשוואה לת דיאטה שליטה זברה.
מצב דומה נצפה באזורי מוח שונים, כגון הטלנצפלון הגבי, ההיפותלמוס, הטיקאטום האופטי, הטורוס Lateralis, וגרעין מפוזר של האונה הנחותה. על ידי כשל חיסוני כפול עם אורקסין-A ו- CB1R קולוקליזציה, הוא ציין כי חלה עלייה של colocalization בנוירונים orexinergic של ההיפותלמוס, מלווה בעלייה של אות פלורסנט orexin-A. תוצאות אלה מראות כיצד שפעת חיסונית כפולה יכולה לסייע בזיהוי ביטוי חלבון שנוסף מבחינה פיזיולוגית, קולוקליזציה של חלבוני יעד ושינויי ההפצה ו/או הביטוי שלהם בתנאים פתולוגיים שונים.
באמצעות immunofluorescence, אנו יכולים להבין טוב יותר את codistribution ו דו דיכוי של ביומולקולים, האינטראקציות האפשריות שלהם, ואנחנו יכולים גם לקבל תמונה גלויה של השינויים שלהם במקרה של פתולוגיות שונות. יתר על כן, ההתפלגות הנוירואנטומית של ביטוי אנזים מטבולי או קולטנים עשויה לחשוף עוד יותר את התפקיד של איתות חלבון בתוך רקמות. העבודה הטכנית הנוכחית הציגה את גישת האימונופלואורסצנטיות כדי לחקור שתי מערכת שמורות מאוד, אורקסין ו אנדוקנבינואידים, באמצעות מודל זברה-דג בוגר.
באמצעות פרוטוקול זה המתואר כאן בפעם הראשונה במוחו של דג זברה בוגר, ההתפלגות האנטומית ודיכוי משותף של קולטני orexin-2 ואת קולטני אנדוקנבינואיד-CB1 לא נקבע. אנו ממליצים על הפרוטוקולים המתוארים כאן לניסויים אימונוהיסטוכימיים ולזהות הפצה מרחבית וארגון של קולטנים בפפטידים בזברות בוגרות כדי להבין טוב יותר את תפקודיהם.
