הפרוטוקול המוצג הוא קל מאוד וזה יעזור לחוקרים להכין תרבויות יותרת הכליה העיקרי. הוא מספק הליך קל להתחלת סטרואידים יותרת הכליה. טכניקה זו עשויה להיות מיושמת על הקרנת מחלות הקשורות ללחץ, כל הפוטנציאלים של התגובות הדלקתיות עכבות הסוכן.
הדגמת ההליך תהיה וואי-צ'אנג לי, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. התחל על ידי עיקור חולדת SD המתת יתד באמצעות 70% אתנול ולתת לו להיספג לתוך העור. לאחר ניגוב העור עם נייר טישו, מניחים את החולדה על צלחת פלסטיק נקייה בתווית supine.
לאחר מכן, השתמש במדפים מעוגלים חיצוניים כדי להרים את העור בקו האמצע. השתמש במספריים כדי לבצע ניתוח קהה של העור על ידי יצירת צורת Y מרמת הירך לזווית התת-קוסטלית. לאחר שטיפת המספריים עם 70% אתנול, לחתוך את השריר, גם יצירת צורה Y.
אתר את בלוטת יותרת הכליה השמאלית מאחורי הבטן בצד ימין מאחורי הכבד. עם זוג מדפים סטנדרטיים וזוג מדפים מעוגלים, להרים את הבטן והכבד ולאחר מכן לבודד את בלוטת יותרת הכליה עם מדפים מעוגלים אחרים ומ מניחים אותם לתוך צלחת סטרילית. השתמש מדפים עדין כדי להזיז בזהירות את קפסולת יותרת הכליה מכל בלוטה.
עכשיו, להשתמש בזוג עדין של מספריים לחתוך את יותרת הכליה לחתיכות קטנות בכמות מספקת של אמצעי DMEM F-12 ללא סרום כדי לכסות את הרקמה. מכינים שלוש פיפטים מאפסטר בגודל מזיגה שונים על ידי חימום אותם על מבער. השתמש פיפטה הראשונה עם הפתח הגדול ביותר כדי להעביר את כל חתיכות יותרת הכליה לתוך צינור חרוט 50mL המכיל בינוני עם Collagenase II.Gently Pipette חתיכות הרקמה למעלה ולמטה על 10 פעמים.
ואז לה הדגירה את הצינור באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך עשרים דקות, ולנער אותו כל חמש דקות, ארבע פעמים בסך הכל. זה מאוד קריטי לבצע כראוי פיזור רקמות במהלך עיכול אנזים. השתמש השני ולאחר מכן פיפטה בגודל לשפוך הקטן ביותר לחזור pipetting ודגירה עד כל חתיכות הרקמה להיות קטן יותר.
לאחר מכן להוסיף נפח פי שישה של bresh בארבע מעלות צלזיוס מדיום קר כדי לעצור את התגובה אנזימטית. ואז centrafuge ב 800 פעמים G במשך 10 דקות, ולהשליך את supernatant בשתי הפעמים. הוסף אמצעי אחסון מתאים של מדיום והשהה מחדש את התאים.
שותלים את התאים בצלחות או בכלים הרצויים עם מדיום גדל לילה ב 37 מעלות צלזיוס ב 95% לחות ו 5% פחמן דו חמצני. למחרת, לשטוף בזהירות את התאים פעמיים עם סרום חינם, חם DMEM F-12 בינוני. מוסיפים מדיום צמיחה טרי ושומרים על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-95% לחות ו-5% פחמן דו-חמצני עד יום 3.
באמצעות פרוטוקול זה, תאי יותרת הכליה של חולדה תרבותית ראשוניים הושגו. יום 3 תאי יותרת הכליה אושרו תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. כתמים immunofluorescent של חלבון הקשורים הידור שומן שבוצעו ביום 3 תרבויות אישר כי שלפוחיות בתוך הציטופלסמה הם טיפות השומנים.
לאחר גירוי הורמון adrenocorticotropic של תאי יותרת הכליה חולדה, יכולת ייצור הורמון של התאים נקבע על ידי בדיקה קורטיקוסטרון, מראה שחרור קורטיקוסטרון מוגבר עם ריכוז ACTH גבוה יותר. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מערכות תרבות ראשוניות אחרות, כגון תרבויות לב ראשוניות, תרבויות medulla יותרת הכליה, וכו '. טכניקה זו עשויה גם לסייע בחקירת האינטראקציה בין תאים אדנוקורטיים ותאי כרואמפין.
