הפרוטוקול שלנו מתאר כיצד להרכיב ולאפיין חשמלית ביו-ממברנה עם סם פפטיד המחקה באופן הדוק את תכונות ההרכב, המבנה וההובלה של הסינפסות הביולוגיות ומפגין עמידות לזיכרון. טכניקה זו מאפשרת למשתמשים להעריך פעילות תלוית פעילות, עמידות בזיכרון ופלסטיות לטווח קצר במערכות מהונדסות בסולמות זמן וברמות העירור הרלוונטיות לסינאפסות ביולוגיות ולערוצי יונים. טכניקה זו מספקת מסגרת לאפיון ממברנות ביומימטיות המכילות תעלות יון המופעלות באמצעות מתח, מה שהופך אותו ישים לאפיון של מגוון תהליכי הובלה תאית, כולל אלה של נוירונים.
ההצעה שלנו לחוקרים חדשים היא קודם כל להיות בקיאים בהכנת פתרונות ליפוזום והרכבת bilayer ממשק טיפה על אלקטרודות חוט סוג. לראות ממקור ראשון את התהליך עבור חלוקת טיפה ומיקום על אלקטרודות מפשט טכניקה זו עבור היווצרות bilayer, מה שהופך אותו נגיש באופן מיידי לכל. הוכחת הליך זה יהיה ד"ר יוסף Najem, פוסטדוק מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל, להכין את פתרון מלאי אלמתיצין בצינור microcentrifuge על ידי המסת אבקת פפטידים אלמתיצין באתנול לריכוז סופי של 2.5 מיליגרם למיליליטר. Vortex הצינור לזמן קצר לערבב היטב, ולאחסן את פתרון המלאי במקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס. בצינור 1.5 מיליליטר Safe-Lock, להוסיף מיקרוליטר אחד של פתרון מלאי אלמתיצין 99 microliters של פתרון A כדי להשיג ריכוז אלמתיצין סופי של 13 micromolar בהשעיית ליפוזום.
מערבולת לערבב היטב. פתרון ליפוזום פפטיד וכתוצאה מכך הוא פתרון B.Mix 117 microliters של פתרון A עם 10 microliters של פתרון B כדי להשיג ריכוז אלמתיצין סופי של micromolar אחד, ולאחר מכן מערבולת לערבב היטב. עיין בפתרון המתקבל כ- C.Store את הפתרונות B ו- C בארבע מעלות צלזיוס.
מניחים צד זכוכית בעובי מילימטר אחד 25 פעמים 75 מילימטרים על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. מחלקים כמה טיפות שמן הקסדקני למרכז מגלשת הזכוכית, ולאחר מכן מניחים את מאגר הנפט ישירות על השמן על מגלשת הזכוכית. מלאו לחלוטין את מאגר הנפט בשמן הקסדקני.
ודא שהמאגר ממוקם מעל העדשה האובייקטיבית. לאחר מכן חבר את מחזיק האלקטרודה לשלב הראש של מגבר זרם המותקן על מיקרומניפולטור. המיקרומניפולטור ממזער את אורך האלקטרודה ואת הרעש החשמלי.
לאחר מכן, הר את מחזיק מיקרופיפט הזכוכית עם חוט הכסף-כסף-כלוריד השני על מיקרומניפולטור אחר. באמצעות מיקרומניפולטורים, למקם את האלקטרודות כך קצות מצופה אגרוז של חוטי כסף כסף כלוריד שקועים לחלוטין לתוך מאגר הנפט במישור אנכי דומה. ליישר את שתי האלקטרודות ולהפריד אותם על ידי כמה מילימטרים.
כדי ליצור את bilayer השומנים, להזיז את האלקטרודות אנכית לתוך שלב השמן. השתמש micropipette להפקיד 200 nanoliters של פתרון השומנים A על כל אחד החוטים. המתן שלוש עד חמש דקות כדי לאפשר הרכבה מונווליאר שומנים ספונטניים להתרחש בממשק שמן המים.
טיפות עלולות לשקוע אם השמן שמסביב הוא מספיק צפוף. לאחר מכן, מנמיכים את האלקטרודות כדי לטביעה מחדש עד שקצוות שתי האלקטרודות בקושי נוגעים בתחתית מאגר הנפט. לאחר מכן, כדי ליצור את bilayer, להזיז את האלקטרודות אופקית כדי להביא את טיפות במגע.
כדי להשיג את הקשר צבט, היסטרי, מתח זרם, להשתמש במחולל פונקציה כדי להחיל צורת גל מתח משולש או סינוזואידית על קרום השומנים נטול אלמתיצין מורכב עם טיפות של פתרון A.Record התגובה הנוכחית המושרה על פני תדרים מרובים. כדי לתעד את גודלו של bilayer השומנים בין גזעי, או למדוד את הקוטר של קרום השומנים במחשב או להקליט את משרעת זרם שיא לשיא הנובע 10 הרץ, 10 מיליליטר גל משולש כדי לחשב את שטח הממברנה. מוציאים את החוטים מתוך שלב השמן כדי להסיר את טיפות המכילות שום אלמתיקן.
הוסף טיפות מים חדשות באמצעות פתרון C וצור bilayer השומנים. בהתבסס על משרעת זרם הגל המרובע, השתמש במיקרומניפולטורים כדי להתאים את המגע בין טיפות, כך שלבילייה יש אזור דומה לזה שנוצר קודם לכן. לאחר מכן החל צורת גל מתח 10-הרץ ו 10-מילי-וולט, ולתרשם את התגובה הנוכחית המושרה כבעבר.
כדי לערוך ניסויי דופק באמצעות תוכנת תכנות מותאמת אישית ומקור מתח אנלוגי, ליצור פולסים מתח עם משרעת גבוהה ונמוכה ספציפית בזמן ובזמן כבוי. הקלט את הזרם בתגובה לפולסים שהוחלו. העלילה של זרם לעומת מתח מראה את התגובה הזרם שאינו אפס על יישום של הטיית מתח bilayer השומנים נטול אלמתיקן.
הוסף 0.017 הרץ, תדר שבו ההימנעות נשלטת על ידי עמידות בפני קרום. תגובה זרם אומי נמוך מוצג עבור קרום בידוד מאוד. העלילה של bilayer השומנים נוצר בין שתי טיפות המכיל פפטידים אלמתיקן מראה זרמים הגדלה אקספוננציאלית במתחים גבוהים יותר מאשר סף הכניסה של 100 מיליבולטים.
במתח גבוה, פפטידים אלמתיקן המתגוררים על פני השטח של bilayer השומנים להכניס לתוך הממברנה לצבור כדי ליצור נקבוביות מוליך. התגובות הנוכחיות הסימטריות בשני הקוטביות נובעות מהכנסה וצבירה של אוכלוסיות פפטידים נפרדות מצדדים מנוגדים של הממברנה. יש להפחית את הזרם ההיסטרי מהזרם הכולל כדי לקבל רק את תגובת מתח זרם ההיסטרסיס הצבוטה והמצמרסיבית.
התגובה memristor biomolecular לפולסים מתח הבאים עם עלייה בהוליכות בזמן, למרות לסירוגין שחזור מצב בידוד במהלך כל זמן חופשה. הן הגירוי הנוכחי והן הגירויים הקודמים תורמים לעלייה הנוכחית. מונוליירים מלוהגים על שתי טיפות חייב להיווצר לפני להביא אותם יחד כדי ליצור את bilayer.
אם טיפות מובאות יחד מוקדם מדי, הם מתמזגים ולא נוצר bilayer. אנו מעצבים וממציאים כעת רשתות עצביות בסיסיות מיקרופלואידיות המורכבות מתאי עצב במצב מוצק המחוברים באמצעות סינפסות מבוססות ממברנה הנתמכות על ידי אופטימיזציה להטמעת רשת של מחשבי-על בעלי ביצועים גבוהים ב- ORNL. מריסטורים אלה הם הראשונים שיש להם את ההרכב, המבנה, מנגנון המיתוג והעברת היונים של הסינפסות הביולוגיות.
לכן הם מספקים בסיס ביומולקולרי מרוהט הוספת מחשוב דמוי מוח וזיכרון.
