פוליפוספט אנאורגני הוא מרכיב מרכזי בתגובת מתח חיידקי. אבל שיטות ישנות יותר לחילוץ ומדידת polyP בחיידקים הן מורכבות ועתירי עבודה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת כימות מהיר, רגיש וזול של רמות ה- polyP במגוון מינים חיידקיים שונים.
ההליך יוכח על ידי אריה פוקרל, סטודנטית לתואר ראשון מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, לגדל חיידקי לקטובצילוס reuteri במדיום אינדוקציה אנזימים מאליים ללא ציסטין ב 37 מעלות צלזיוס לילה בלי לרעוד. צנטריפוגה מיליליטר אחד של תרבות לילה זו בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר כדי לקצור מספיק תאים כדי להניב סך של 50 עד 100 מיקרוגרם של חלבון הסלולר.
הסר את supernatant מן גלולת התא לחלוטין, ולאחר מכן להוסיף 250 microliters חיץ תזה GITC ו resuspend על ידי מערבולת. דגירה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי ללטף את התאים. אחסן את הליסט ב-80 מעלות צלזיוס.
תחילה, הכן תקני BSA המכילים אפס, 1, 2 ו- 4 מיליגרם למיליליטר של BSA במאגר תותבת GITC. Aliquot חמישה microliters של מופשר, lysates תא מעורב היטב וחמישה microliters של תקני BSA להפריד בארות בצלחת ברורה 96 באר. הוסף 195 מיקרוליטרים של ברדפורד reagent לכל באר ולמדוד ספיגה ב 595 ננומטרים קורא לוח.
חשב את כמות החלבון בכל באר בהשוואה לעקומה הסטנדרטית של BSA כמתואר בכתב היד. כדי לקבוע את כמות החלבון הכוללת בכל דגימה, הכפל את הערך המתקבל ב- 05. כדי להתחיל מיצוי פוליפוספט, להוסיף 250 microliters של 95%אתנול לכל מדגם lysed GITC, ומערבולת לערבב.
פיפטה תערובת זו לעמוד ספין קרום סיליקה ממוקם בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 16, 100 גרם במשך 30 שניות. השלך את הזרימה דרך ולהוסיף 750 microliters של טריס הידרוכלוריד, נתרן כלורי, EDTA, ותערובת אתנול.
צנטריפוגה ב 16, 100 גרם במשך 30 שניות. השלך את הזרימה דרך צנטריפוגה עמוד ספין ב 16, 100 gs במשך שתי דקות. מניחים את העמוד בצינור מיקרופוג נקי של 1.5 מיליליטר.
מוסיפים 150 מיקרוליטרים של 50 מילימולרים pH שמונה טריס-הידרוכלוריד, ודגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. Elute polyP על ידי צנטריפוגה ב 8, 000 גרם במשך שתי דקות. התחל על ידי הכנת סטנדרטים המכילים אפס, חמש, 50, או 200 אשלגן מיקרומולארי פוספט ב 50 מילימולאר pH שמונה טריס הידרוכלוריד.
Aliquot 100 microliters של כל תקן פוספט ו 100 microliters של דגימות polyP שחולצו לתוך בארות נפרדות של צלחת ברורה 96 באר. הכינו תערובת אב המכילה, לפי מדגם, 30 מיקרוליטרים של מאגר תגובה 5X ScPPX, 19 מיקרוליטר מים, ומיקרוליטר אחד של ScPPX מטוהר.
ותגרה במשך 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. ביום הגילוי, הכינו מלאי עבודה טרי של פתרון איתור על ידי ערבוב של 9.12 מיליליטר של בסיס פתרון איתור עם 88 מיליליטר של חומצה אסקורבית טוחנת אחת, ואפשרו לה להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש. הוסף 50 מיקרוליטרים של פתרון זיהוי לכל מדגם ותקנים בצלחת 96 באר.
כדי לאפשר התפתחות צבע, הדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך כשתי דקות. השתמש בקורא לוחות כדי למדוד ספיגה ב 882 ננומטר ולחשב את ריכוז הפוספט של כל מדגם בהשוואה לעקומה הסטנדרטית אשלגן פוספט. לאחר מכן להמיר את ריכוזי הפוספט ננומולים של פוליפ נגזר פוספט בכל מתא lysate ולנרמל תוכן polyP הסלולר לחלבון הסלולר הכולל, כמתואר בכתב היד.
E.coli מסוג פראי, חיידק גרם שלילי, גדל LB מיוצר ללא פוליפ. אבל כאשר גדל ב- MOPS, מיוצר על 192 ננומולים polyP לכל מיליגרם של חלבון הכולל. מוטציה דלתא ppk E.coli, אשר חסר polyP קינאז, לא הפיק פוליפ באף אחד מהמדיום.
מוטציית דלתא ppx, אשר חסר exopolyphosphatase, הפיק בערך את אותה כמות של polyP כמו סוג הבר. והמוטנט דלתא phoB, שהוא פגום בהובלת פוספט, הפיק באופן משמעותי פחות פוליפ מאשר סוג הבר. L.reuteri מסוג פראי, חיידק גרם חיובי גדל בן לילה במדיום MEIC צבר כ 51 ננומולים polyP למיליגרם של חלבון הכולל.
מוטציה L.reuteri ppk1 null חסר קינאז polyP הכיל פחות ממחצית הסכום הזה. נוכחות זו של polyP במוטנט ppk1 null היא כנראה בשל L.reuteri המכיל קינאז polyP השני. Mycobacterium smegmatis זן SMR חמש, גדל במדיום Hartmans-de Bont בהיעדר אתנול צבר כ 141 ננומולים polyP למיליגרם של חלבון הכולל.
בעוד טיפול אתנול הביא לעלייה משולשת. בעקבות הליך זה, אלקטרופורזה ג'ל אקרילאמיד יכול להתבצע כדי להעריך את ההבדלים באורך שרשרת polyP. בעת ניסיון הליך זה, הימנע מטעויות נפוצות.
זכור להימנע מקבל בועות בארות צלחת microtiter, ולהיזהר להעביר את הדגימות שלך לצינור המתאים בעת מעבר מהעמודה לצינור microfuge. אל תשכח כי עבודה עם GITC וחומצות חזקות יכול להיות מסוכן, וציוד מגן הנכון תמיד צריך להיות משוחק בעת ביצוע הליך זה.
