זהו המאמר הראשון המטפל בבעיות טכניות ברצף RNAs קטנים הנגזרים מנוזלים חוץ-תאיים מתאים. דגימות NGS דורשות הכנה מחמירה ובקרת איכות. בשל אופי של כלי רכב חשמליים, תהליך QC של דגימות EV חורג מהנורמה.
היתרון של פרוטוקול זה הוא שלבי QC בו עבור משתמשים בפעם הראשונה. הדגימה של ההליך תהיה ג'וני סו, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, צלחת תאי גזע mesenchymal אנושי ב 2, 000 תאים לסמטר מרובע במדיה MSC טריים בחמישה בקבוקונים T175.
לאחר מכן לגדל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה 5%פחמן דו חמצני ולהחליף את המדיה כל יומיים עד שלושה ימים, עד חמישה בקבוקונים של 90% תאים confluent מתקבלים. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 20 מיליליטר של PBS לכל בקבוק. הוסף 20 מיליליטר של מדיה אוסף EV לתוך כל בקבוקון.
ו דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה 5%פחמן דו חמצני במשך 48 שעות. לאסוף את התקשורת צנטריפוגה זה במשך 10 דקות ב 300 גרם וארבע מעלות צלזיוס. ואז לאסוף את supernatant, ו צנטריפוגה התקשורת במשך 20 דקות ב 2, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס.
לאסוף את supernatant שוב, צנטריפוגה התקשורת במשך 30 דקות ב 15, 500 גרם וארבע מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatant בפעם האחרונה. לאחר מכן, העבר את התקשורת לצינורות אולטרהצנטריפוגה.
רוטור זווית קבועה 60Ti משמש כאן, ואת גלולה יהיה מעוגן בצד של הצינור. סמן את הצד של המכסה שבו גלולה צפויה, ולצייר עיגול בצד של הצינור שבו גלולה צפויה. ו גלולה exRNAs במשך 90 דקות ב 100, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס.
לאחר הצנטריפוגה הסופית, הסר את העל-טבעי. השתמש חתיכות קטנות של נייר סופג לייבש את החלק הפנימי של הצינור מבלי לגעת בחלק התחתון של הצינור. ואז להפוך את הצינור על נייר סופג.
כדי להשתמש מחדש את גלולה, להוסיף 200 microliters של PBS לתוך כל צינור, ומערבולת הצינור במשך 30 שניות. פיפטה למעלה ולמטה 20 פעמים. לאחר מכן להעריך את הווסקולים החוץ-תאיים וביומולקולות אחרות עם ניתוח מעקב חלקיקים.
ולאחסן את גלולה במינוס 80 מעלות צלזיוס עד ניסויים נוספים. לאחר הפשרת הדגימות, השתמש בערכת בידוד RNA כדי לחלץ RNA בהתאם לפרוטוקול היצרן. אלוט RNA מהטור המסופק בערכת בידוד RNA ב 100 microliters של מים ללא RNAse.
כדי לרכז את ה-RNA באמצעות משקעים אתנול, להוסיף מיקרוליטר אחד של גליקוגן, 10 microliters של pH-5.5 נתרן אצטט שני טוחן, ו 250 microliters של 99% אתנול מקורר מראש לתוך 100 microliters של RNA מטוהרים. ואז להדגיר את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס לילה כדי לזרז את RNA. כדי גלולה RNA, צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 16, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, להסיר את supernatant, ולשטוף את גלולת RNA עם מיליליטר אחד של 75%אתנול. צנטריפוגה שוב במשך חמש דקות ב 16, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס כדי גלולה RNA. הסר את האתנול, ולהשאיר את המכסה של צינור RNA פתוח במשך חמש עד 10 דקות כדי לייבש את האוויר גלולת RNA.
השתמשו שוב את גלולת ה-RNA בשבעה מיקרוליטרים של מים נטולי RNAse, ולהשתמש במכונת אלקטרופורזה נימית מבוססת שבב כדי לזהות את האיכות והריכוז של ה-RNA. כדי להתחיל בבניית הספרייה, פיפטה חמישה מיקרוליטרים של ה-RNA לתוך צינור PCR מקורר מראש 0.2 מיליליטר. לאחר מכן, לדלל 3'מתאמים במים ללא RNAse ביחס נפח של 1 עד 10.
הוסף 0.5 microliters של המתאם מדולל לתוך צינור RNA, ו pipette את התערובת למעלה ולמטה שמונה פעמים. צנטריפוגה בקצרה כדי לאסוף את כל הנוזל בתחתית הצינור. דגירה תערובת מתאם RNA ב 70 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות במחזור תרמי שחומם מראש.
ואז למקם את המדגם בחזרה על הבלוק מקורר. לאחר מכן, הוסיפו מיקרוליטר אחד של מאגר הרצועות, 0.5 מיקרוליטרים של מעכבי RNAse ו-0.5 מיקרוליטרים של ליגאז T4 RNA לתערובת מתאם ה-RNA. פיפטה למעלה ולמטה שמונה פעמים, וצנטריפוגה לזמן קצר.
ואז דגירה הצינור ב 28 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת במחזור התרמי שחומם מראש. לאחר מכן, להוסיף 0.5 microliters של פתרון עצירה לתוך הצינור מדגם, עם הצינור להישאר רוכב האופניים התרמי. פיפטה למעלה ולמטה שמונה פעמים, וממשיכה להידגר ב-28 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
לדלל מתאמים 5'במים ללא RNAse ביחס נפח של 1 עד 10. הוסף 0.5 מיקרוליטר של המתאם המדולל לצינור PCR נפרד של 0.2 מיליליטר. מחממים את ה-5 ב-70 מעלות במשך שתי דקות.
ואז מניחים את הדגימה על הבלוק המצונן. הוסיפו 0.5 מיקרוליטרים של ATP של 10 ננומול ו-0.5 מיקרוליטרים של רצועת ה-T4 RNA לצינור המתאם 5'. פיפטה למעלה ולמטה שמונה פעמים.
וצנטריפוגה בקצרה כדי לאסוף את כל הנוזלים לתחתית. לאחר מכן, הוסיפו 1.5 מיקרוליטרים של תערובת ה-5 אינץ' לדגימה של ה-RNA. פיפטה פי שמונה בעדינות רבה, ודגירה את המדגם ב 28 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
כדי להשיג cDNA, לדלל את פריימר תעתיק הפוך במים ללא RNAse ביחס נפח של 1 עד 10. הוסף 0.5 microliters של פריימר מדולל לתוך מדגם RNA, פיפטה שמונה פעמים בעדינות רבה, צנטריפוגה בקצרה. לאחר מכן הדגירה את RNA ואת תערובת פריימר ב 70 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות במחזור התרמי שחומם מראש.
ואז מניחים את הדגימה על בלוק מצונן. לאחר מכן, הוסיפו מיקרוליטר אחד של חיץ סטרנד ראשון 5X, 0.5 מיקרוליטרים של תערובת DNTP 12.5 מילימולאר, 0.5 מיקרוליטרים של DTT 100 מילימולאר, 0.5 מיקרוליטרים של מעכב RNAse, ו 0.5 מיקרוליטר של תעתיק הפוך לתוך צינור המדגם. פיפטה שמונה פעמים בעדינות רבה.
וצנטריפוגה לזמן קצר. דגירה המדגם ב 50 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת במחזור התרמי שחומם מראש. לאחר מכן, הוסיפו 4.25 מיקרוליטרים של מים אולטרה-יציבים, 12.5 מיקרוליטרים של תערובת ה-PCR, מיקרוליטר אחד של פריימר האינדקס ומיקרוליטר אחד של פריימר אוניברסלי לדגימה של CDNA.
פיפטה למעלה ולמטה שמונה פעמים, וצנטריפוגה לזמן קצר. לבסוף, מניחים את המדגם במחזור תרמי, ולהגדיר את העגל על פי כתב היד. כדי לטהר את ספריית ה- RNA, השתמש בשבר גודל דנ"א אוטומטי כדי להפוך את הרצועות בין 140 ל- 160 זוגות בסיסים.
הפעל את הספריה שחולצו על ערכת טיהור PCR מבוססת עמודה, והטיף את הספריה ב- 10 מיקרוליטרים של מים ללא RNAse. כדי לבדוק את גודל הספרייה, טען מיקרוליטר אחד של הספרייה המטוהרת על שבב DNA ופעל בהתאם לפרוטוקול היצרן. כדי לכמת את ריכוז הספרייה, תחילה לדלל מיקרוליטר אחד של הספרייה המטוהרת ב pH-8.0 טריס-Hcl 10-מילימולרית עם 0.05%polysorbate 20 ביחס נפח של אחד ל-1, 000.
לאחר מכן הפעל QPCR באמצעות תקני ה- DNA של ערכת כימות הספרייה המסחרית. לבסוף, מאגר כמויות שוות של הספריות בהתאם לדרישות מכונת הרצף, ורצף על מערכת ריצוף תפוקה גבוהה. האלקטרופרוגרמה של RNAs חוץ-תאיים כללה מגוון רחב של רנ"א.
לעומת זאת, RNA הסלולר הראה פסגות ברורות מאוד, המקביל 5StRNA, 5.8SrRNA, 18SrRNA, ו 28SrRNA. האיכות הנובעת משתי הספריות הייתה גבוהה ודומה. התפלגות האורך של שתי הספריות הראתה שיא אחד ב-22 נוקלאוטידים, עם קורלציה עם מיקרו-רנאים.
לעומת זאת, הספריות מ- RNAs חוץ-תאיים היו הטרוגניות יותר, שהכילו שתי פסגות נוספות המתואמים עם tRNAs, חצאים וקטעים, או piRNAs. 65% מהקריאות מ-RNA תאי מופו למיקרו-רנ"א אנושי, וכל אחד מה-RNAs הקטנים האחרים היווה חלק קטן מהקריאות הממופות. לעומת זאת, רק 8% מ- RNAs חוץ-תאיים תואמים למיקרו-RNAs אנושיים.
ה- RNA הקטן הנפוץ ביותר שאליו מופו ההיקראות היו tRNAs, והקריאות שאין כמוהן תאמו מאוחר יותר לרצפי חיידקים. השוואה לגנום בקר הציעה כי FBS לא היה מקור לזיהום. לפיכך, RNAs חוץ-תאיים מציגים פרופיל לא טיפוסי בהשוואה ל-RNA תאי רגיל.
הכנת הספרייה היא חלק חיוני בפרוטוקול זה. ערבוב חייב להיעשות בעדינות רבה כדי למנוע בועות מלהרכיב. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור את הפרופיל של exRNAs מסוגים אחרים של תאים, אשר מסייע ללמוד את הפונקציה של exRNAs.
