איתות דיסווסוקס מחדש מעורב בפתוגנזה של מחלות מגוונות. המחקר של ביולוגיה redox דורש זיהוי מדויק של מינים חמצן תגובתי בתאי תאים ורקמות שונים. ספקטרוסקופיה EPR היא השיטה היחידה המודדת רדיקלים חופשיים באופן חד משמעי.
פרוטוקול זה מדגים שיטה מעשית לטיפול ואחסון של דגימות ביולוגיות לספקטרוסקופיה EPR. פרוטוקולים אלה ממחישים את השימוש בבדיקות EPR וספין בשני מודלים מייצגים. למרות שהם יכולים להיות מותאמים כדי להעריך את המינים הפעילים במסגרות ביולוגיות אחרות.
תכנון הניסוי והטיפול בדגימה הם קריטיים לשחזורו. אנו ממליצים לשקול את צפיפות התאים ולהבטיח פקדים מתאימים תואמי זמן. התחל על ידי שטיפת עדין של 264.7 תאים גולמיים עם מיליליטר אחד של מאגר קרבס-Henseleit או KHB, לבא.
ולטפל בתאים עם 500 microliters של KHB, בתוספת 100 micromil של DTPA לבא. כדי להתמודד עם סופראוקסיד דיסמוטאז, להוסיף 15 microliters של מלאי סופראוקסיד דיסמוטאז, או רכב, לכל באר, ולה מניחים את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בסוף טיפול מקדים סופראוקסיד דיסמוטאז, להוסיף 12.5 microliters של 10 CMH מילימולרית ו 40 microliters של 125 פתרון עבודה PMA מיקרומולרי ל הבארות המתאימות, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 50 דקות.
מיד מניחים את הצלחות על קרח ולאסוף את החיץ מכל באר לתוך צינורות בודדים 1.5 מיליליטר על קרח. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של KHB טרי בתוספת DTPA לכל באר בעדינות לגרד את התאים מתחתית כל באר. לאחר מכן תן שימוש חוזר במתלי התא עם צינורות והעבר את התאים לצינורות בודדים של 1.5 מיליליטר על קרח.
לגילוי סופראוקסיד בטמפרטורת החדר, תחילה לטעון 50 microliters של חיץ אחד או מדגם תא לתוך צינור נימי ולאטום את הצינור. מיד למקם את הצינור לתוך תהודה paramagnetic אלקטרון, או EPR, ספקטרומטר ולהגדיר את הפרמטרים רכישת EPR עבור מדידות טמפרטורת החדר. בדוק תמיד מדגם ריק של מאגר המכיל את אותו ריכוז של בדיקה שטופלה באותם תנאים ניסיוניים כמו בקרה.
לגילוי סופראוקסיד ב 77 מעלות קלווין, לטעון 150 microliters של מדגם אחד לתוך חתיכה אחת עד שתיים אינץ 'של polytetrafluoroethylene ישר, או PTFE, צינורות, עם פקק גומי בקצה אחד. לאטום את הקצה השני של הצינור עם פקק שני פלאש להקפיא את המדגם בחנקן נוזלי. לאחר מכן הסר במהירות את הפקקים והנח את צינורות PTFE בקריפטוטובה מסומנת לאחסון חנקן נוזלי.
למדידות EPR, מלאו את האצבע של ספקטרומטר EPR בחנקן נוזלי והניחו את צינורות PTFE המכילים את הדגימה בחנקן הנוזלי. מקם את דיואר האצבע בספקטרומטר EPR והגדר את פרמטרי רכישת EPR למדידות ב- 77 מעלות קלווין. לגילוי ROS ברקמת ריאה קפואה, מניחים את הרקמה על קרח יבש ולהשתמש פינצטה כדי לייצב את הרקמה קפואה פלאש על קרח יבש.
חותכים את הדגימה לחמש חתיכות 15 מיליגרם, ולשקול את החלקים בצינור מוכתם 1.5 מיליליטר. הוסף 196 microliters של KHB בתוספת DTPA וארבעה microliters של CMH לדגימה, ולהדגיר את דגימת הריאות במשך שעה אחת באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפני pelleting שברי הרקמה עם צנטריפוגה קצרה. לאחר מכן מניחים את המדגם על קרח לפני העברת 150 microliters של supernatant לתוך חתיכת צינורות PTFE להקפאת פלאש כהכנה של מדידת EPR כפי שהודגם רק.
הערכה של ייצור סופראוקסיד הכולל בתאים גולמיים 264.7 מגורה עם PMA כפי שהוכח, מגלה כי ריכוז nitroxide הן המתלה התא ואת המאגר של תאים שטופלו PMA דומה, בשל הטבע חדיר שיווי משקל מהיר של החללית ספין. רדיקלים nitroxide אות עליות בתאים גולמיים 264.7 מגורה עם PMA, בהשוואה לתאי בקרה, אבל לא בתאים מטופלים מראש עם תאים בלתי חדירים סופראוקסיד ביסמוטאז. הריכוז של nitroxide המתקבל בטמפרטורות נמוכות בתאים גולמיים 264.7 לאחר גירוי עם PMA הוא גם התמת בנוכחות סופראוקסיד סיסמוטאז עולה בקנה אחד עם נתוני טמפרטורת החדר.
ריכוז הניטרוקסיד גדל בדם ובנוזל לוויתן ברונכואלוולאר של עכברי בלו ועכברים מטופלים, כמו גם בתוך העל-טבעיים של חתיכות רקמת ריאה שנקטפו מעכברי בלו ובעלי חיים פצועים, בהשוואה לפקדים שטופלו ב- PBS. יתר על כן, לאחר הזרקת גשושית ספין מסלולית רטרו, עכברי בלו ובעלי חיים מטופלים מדגימים אות גשושית ספין גבוה יותר בהשוואה לפקדים. פרוטוקולים מעשיים אלה יאפשרו לחוקרים לבחון ייצור רדיקלים חופשיים בתאים סלולריים שונים ודגימות ביולוגיות על ידי EPR, כולל מדידות טמפרטורה נמוכה.
