Name: preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries
Uploaded: 2018-08-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries at JoVE.com

הפרויקט מומן על ידי אוניברסיטת הנורבגית מועצת המחקר של נורבגיה, מספר גרנט 243811 ו- 244461 (חקלאות ימית תוכנית) ומדעי החיים. אנו אסירי תודה לורדס טאן Carreon באוניברסיטה נורבגי למדעי החיים לשמירה על המתקן דגים.

הניסויים בבעלי חיים שבוצעה במחקר זה אושרו על-ידי אוניברסיטת הנורבגית מדעי החיים, הקווים המנחים הבאים טיפול ולרווחתם של בעלי חיים למחקר.
1. הכנת פתרונות
<ol><li>כיילו את המכשירים מד osmometer ו- pH לפי הוראות היצרן כדי לוודא המידות הנכונות.</li>
	<li>
הכנת 500 מ"ל של Ca2 +- ומ ג2 +-חינם באגירה פוספט תמיסת מלח של Dulbecco (dPBS), התאמת רמת ה-pH ל 7.75 (שלב 1.2.1), את osmolality כדי 290 mOsm/kg (שלב 1.2.2) לפני סינון סטרילי (שלב 1.2.3).
	<ol>
<li>להתאים את ה-pH ל 7.75 עם מד pH מכוילת על-ידי הוספת בקפידה טיפות NaOH 1 M פתרון תוך בקפידה תוך ערבוב את הפתרון.</li>
		<li>למדוד את osmolality של הפתרון באמצעות osmometer מכויל ולחשב את הכמות של מניטול הדרושים כדי להגדיל את osmolality כדי mOsm 290/ק"ג. להוסיף את הכמות הנדרשת של מניטול, ואז למדוד את osmolality של הפתרון שוב על מנת לוודא את ההתאמה הנכונה. הערה: הסכום של מניטול הדרוש תלוי osmolality נמדד, אשר בדרך כלל משתנה בין קבוצות שונות. מולקולה אחת של מניטול שווה 1 חלקיק osmotic.</li>
		<li>סטרילי-מסנן הפתרון dPBS באמצעות מסנן 0.2 µm. הערה: הפתרון ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 חודשים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת 500 מ"ל של ליבוביץ (L-15) בינוני תרבות ללא-גלוטמין, ביקרבונט, תוספת זה עם 10 מ מ NaHCO3 (שלב 1.3.1), גלוקוז 4.5 מ מ (שלב 1.3.2) ו 2 מ מ גלוטמין זמין מסחרית (שלב 1.3.3). להתאים את הפתרון mOsm 290/ק"ג (שלב 1.3.4), מסנן סטרילי זה (שלב 1.3.5), ולהוסיף 2.5 מ של פתרון פניצילין-סטרפטומיצין (שלב 1.3.6). הערה: הפתרון ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לפחות 4 שבועות.<ol>
<li>הוסף 420 מ ג של NaHCO3 לכל 500 מ"ל של תרבות מדיום כדי להשיג פתרון 10 מ מ.</li>
		<li>הוסף 405 מ"ג גלוקוז לכל 500 מ"ל של תרבות מדיום כדי להשיג פתרון 4.5 מ מ.</li>
		<li>הוסף 5 מ של 100 x מלאי של פתרון גלוטמין 500 מ"ל של תרבות מדיום כדי להשיג פתרון 2 מ מ. מערבבים עד מומסים בגבול כל הם התפרקה.</li>
		<li>להתאים את הפתרון mOsm 290/kg עם מניטול באמצעות של osmometer (כפי שבוצעה בשלב 1.2.2).</li>
		<li>ביצוע של סינון סטרילי של המדיום L-15 באמצעות מסנן 0.2 µm.</li>
		<li>לאחר סינון סטרילי, להוסיף 2.5 מ של פתרון פניצילין-סטרפטומיצין, המתאים U/mL 50 של פניצילין, µg 50/mL של סטרפטומיצין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין 50 מ של הפתרון טריפסין באמצעות 1 מ"ג/מ"ל של טריפסין (0.1%) סוג ש-II-S מומס dPBS שונה (להכין בשלב 1.2). להפוך aliquots של 2 mL צינורות פלסטיק סטרילית ואחסן אותם ב-20 ° C עד השימוש. הערה: Aliquots של 2 מ ל ניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 חודשים.</li>
	<li>הכנת 50 מ של מעכבי טריפסין הפתרון באמצעות 1 מ"ג/מ"ל של (0.1%) טריפסין מעכב סוג אני-S, משלימים את זה עם 2 µg/mL של DNase אני מומס dPBS שונה (להכין בשלב 1.2). להפוך aliquots של 2 mL צינורות פלסטיק סטרילית ואחסן אותם ב-20 ° C עד השימוש. הערה: Aliquots של 2 מ ל ניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 חודשים.</li>
</ol>2. הכנת ציוד
<ol><li>הכן פיפטות זכוכית על ידי אש ליטוש הטיפ על דיסוציאציה התא. לגרום לתיאורי עם 2 קטגוריות גודל שונה (פתיחה בינונית של 0.6-0.8 מיקרומטר, פתח קטן של 0.4-0.6 מיקרומטר) על ידי משחק עם הזמן, המרחק בין הלהבה בזמן בו זמנית מפנה את פיפטה. למקם את פיפטות זכוכית מיכל הזכוכית נקי, החיטוי אותם (באמצעות מצב מוצק ב 105 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות).</li>
	<li>הכנת קופסה פוליסטירן עם קרח.</li>
	<li>הכן צינור פלסטיק עם 1.5 מיליליטר ששונה dPBS (להכין בשלב 1.2) להעביר את pituitaries כדי בזמן ולשמור אותו בקרח.</li>
	<li>הכן צינור 15 מ"ל עם 10 מ"ל של dPBS שונה (להכין בשלב 1.2) ולשמור אותו בקרח עד דיסוציאציה התא.</li>
	<li>להכין טרי או להפשיר aliquots של טריפסין ופתרונות מעכבי טריפסין (להכין בשלבים 1.4 ו- 1.5) ולשמור אותם על קרח עד השימוש.</li>
	<li>הגדר את המים הרותחים 26 ° C לפני שמתחילים את הקרע כדי לאפשר להם להגיע לטמפרטורה הרצויה לפני הדיסוציאציה הכימית של pituitaries.</li>
	<li>נקה כל כלי חיתוך עם אתנול 70% לפני, במהלך, ואחרי שימוש, כולל מלקחיים בסדר לשימוש את הקרע ומחטים צלחת שעווה בסדר להפיל. את הדג. שימוש בכפפות נקי (לשנות ולנקות בתדירות גבוהה) במהלך ההליך כולו כדי למנוע זיהום פוטנציאליים של התאים.</li>
</ol>3. יותרת המוח לנתיחה, דיסוציאציה תא
<ol><li>המתת חסד את הדג על ידי אנו ממליצים אותה ice הרפש (0 ° C). השאירו את הדגים הרפש קרח לפחות 1 דקות להבטיח מכת חום בלתי הפיך. הערה: הנייח ואיבוד שיווי משקל יתרחש לאחר מספר שניות. ודא הדג לגמרי שקוע במים קרח לא משקר על הקרח, האחרון יוביל מחנק, נשרף פוטנציאליים במקום הלם חום מהירה והומאני.</li>
	<li>להעביר את הדג ברשת צלחת שעווה תחת המיקרוסקופ לנתיחה ובמהירות להשמיד את עמוד השדרה על ידי אגרוף המחט דרך הצוואר.</li>
	<li>להצמיד את ראש הדג לצלחת השעווה באמצעות מחטים בסדר, על ידי החדרת מחט אחת מקדימה (מעל הפה), אחד בכל צד של הראש (מאחורי המוח) כדי לייצב את הראש לפני הקרע.</li>
	<li>הצג את הדג תחת המיקרוסקופ לנתיחה, לגרד בעדינות את המאזניים בחלק העליון של הראש באמצעות מלקחיים בסדר עם קצה זוויתי.</li>
	<li>בזהירות בקצה בזווית של המלקחיים בסדר מתחת לעור מהצד של הראש האצוהו גג הגולגולת על ידי נעים באיטיות המלקחיים בכיוון של הפה, תוך החזקת אחיזה חזקה כדי המלקחיים תוחמת את הגג הגולגולת.</li>
	<li>לחתוך חוט השדרה לחלוטין באמצעות מלקחיים עם קצה זוויתי. הערה: הזמן הוא גורם חשוב, ולכן לעבוד ביעילות ובילה במדויק כדי להגביל את משך הזמן של ניתוח pituitaries עד התאים הם מצופים בצלחת. לאחר אימון, ניתוח יותרת המוח צריך לקחת בסביבות 2-3 דקות לכל הדגים, אשר רק סביב 10 s יש צורך לבחור את בלוטת יותרת המוח כאשר המוח כבר נחשף.</li>
	<li>בזהירות להתהפך המוח לכיוון הפה כדי לחשוף את בלוטת יותרת המוח, לנתח את זה. עם מלקחיים נקי עם טיפ ישר. בלוטת יותרת המוח להעביר צינור פלסטיק המכיל 1.5 mL שונה dPBS (לפרטים, ראה שלב 2.3) מניחים על קרח. בדוק את קצה המלקחיים מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח בלוטת יותרת המוח מתווסף בהצלחה הצינורית נשאר כלום ב המלקחיים. הערה: לנתח כמה שיותר pituitaries לפי הצורך, בהתאם למספר מנות תרבות ואנחנו רוצים להיות מוכנים בו זמנית. כלל אצבע, לחשב לפחות 10 pituitaries דגים בוגרים לכל מאכל יש צפיפות המתאים של תאים (אשר תלוי ביישום במורד הזרם).</li>
	<li>ספין למטה pituitaries ומפרידה שולחן עבור 1 – 2 s בטמפרטורת החדר. בזהירות להסיר את dPBS באמצעות פיפטה של זכוכית, לטפל כדי למנוע הסרת כל pituitaries.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של הפתרון טריפסין (להכין בשלב 1.4) לשטוף את pituitaries, לסובב אותם למטה ומפרידה שולחן עבור s 1 – 2, ולהסיר רוב הנוזל באמצעות פיפטה מזכוכית לפני הוספת נוספים של 1 מ"ל של טריפסין פתרון.</li>
	<li>דגירה הצינור באמבט מים בטמפרטורה 26 ° C למשך 30 דקות, רצוי עם טלטולים עדינים, או לחלופין, קפיצי ברכבת התחתית מספר פעמים במהלך תקופת הדגירה.</li>
	<li>ספין למטה pituitaries ומפרידה שולחן עבור 1 – 2 s בטמפרטורת החדר וודא כי כל pituitaries ממוקמים בחלק התחתון של הצינור. להסיר את מרבית הפתרון טריפסין עם פיפטה מזכוכית ולהוסיף 1 מ"ל של הפתרון מעכבי טריפסין (להכין בשלב 1.5) כדי להשבית את טריפסין. ולשטוף את pituitaries.</li>
	<li>לאסוף את pituitaries בחלק התחתון של הצינור על ידי מסובב אותם למטה ומפרידה שולחן עבור 1 – 2 s בטמפרטורת החדר. להסיר את רוב הנוזל עם פיפטה מזכוכית ולהוסיף 1 מ"ל של הפתרון מעכבי טריפסין (להכין בשלב 1.5). למקם את הצינור באמבט מים בטמפרטורה 26 ° C למשך 20 דקות, רצוי עם טלטולים עדינים, או לחלופין, קפיצי ברכבת התחתית מספר פעמים במהלך תקופת הדגירה כדי להשבית את טריפסין.</li>
	<li>להכין תבשיל תרבות תא פולי-d-ליזין-מצופה 35 מ מ עם חלק תחתון זכוכית המרכזי על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיום L-15 ולתת את תקופת דגירה של פחות 10 דקות בטמפרטורה 26 ° C, ב- 1% CO2 , כך שזה יכול להגיע נכון טמפרטורה, pH לפני ציפוי התאים. הערה: לצלחת תרבות תא פלסטיק יכול גם לשמש. היתרון העיקרי של שימוש צלחת עם חלק תחתון זכוכית מרכזי הוא כי האזור שבו התאים הם מצופה הוא קטן יותר, לכן, פחות תאים יותרת המוח נדרשים לכל תבשיל. במורד יישומים מסוימים עשויים לדרוש גם חלק תחתון זכוכית (כלומר, כמה טכניקות הדמיה).</li>
	<li>הגדר לצנטריפוגה קירור עד שהשפופרות 15 מ"ל 4 ° C כדי לאפשר לו להגיע לטמפרטורה הרצויה לפני שמתחילים את הדיסוציאציה מכני.</li>
	<li>לאסוף pituitaries בחלק התחתון של הצינור על ידי ספינינג למטה ברכבת התחתית עם הפתרון מעכבי טריפסין (מתוך שלב 3.11) ומפרידה שולחן עבור 1 – 2 s בטמפרטורת החדר וודא כי כל pituitaries ממוקמים בתחתית השפופרת לפני בזהירות הסרת מרבית הפתרון מעכבי טריפסין באמצעות פיפטה של זכוכית. הערה: בצע את כל השלבים הבאים של פרוטוקול ספסל זרימה שכבתית (נולדנו) מוסמך לעבודה תא למנוע זיהום של התאים.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של קרח dPBS שונה (להכין בשלב 2.4) החלקים רקמת יותרת המוח ותשאבו בעדינות את חתיכות רקמה למעלה ולמטה (x 6 – 7) פיפטה מזכוכית מלוטשת-אש (להכין בשלב 2.1). הערה: הטמפרטורה היא היבט חיוני, אז תמשיך כל הפתרונות ב 4 º C. מנקודה זו ואילך, לבצע את כל השלבים על קרח במידת האפשר.</li>
	<li>ספין למטה חתיכות רקמה ומפרידה שולחן עבור 1 – 2 s בטמפרטורת החדר ולהעביר בזהירות את החלק העליון של dPBS המכילות את התאים dissociated (כמעט 1 מ"ל) צינור 15 מ"ל על קרח. להימנע מלעבור על פיפטה בחלק התחתון של הצינור שבו נותרו חתיכות רקמה.</li>
	<li>חזור על שלב 3.16 – 3.17, בריא תאי 1 מ"ל של dPBS קר כקרח בכל פעם, עד נעשה שימוש כל 10 מ"ל של dPBS. להתחיל להשתמש על פיפטה מזכוכית עם פתיחת בגודל בינוני, לעבור פיפטה מזכוכית עם חור קטן יותר לקראת הסוף (עבור mL 3-4 האחרון של dPBS הוסיף) הדיסוציאציה. אם יש עדיין גלויים חתיכות רקמה לקראת סוף התהליך דיסוציאציה, להגדיל את pipetting ל- x כ 10 לכיוון המדרגות אתמול 2 של dPBS על דיסוציאציה, בסופו של דבר להשאיר את חתיכות רקמה שיורית. Resuspend התאים בעדינות, הימנע מיצירת בועות, שכן היא עלולה לגרום נזק לתאים, כאשר התאים לצרף פני השטח של הבועות. הערה: זהו שלב קריטי של פרוטוקול זה והוא דורש הכשרה כדי להשיג תוצאה טובה.</li>
	<li>לאזן את הצינור צנטריפוגה (טרום מקורר עד 4 ° C) ו ספין למטה התאים ב x 200 גר' 10 דקות ב 4 º C. הקפד לסמן את הצד של הצינור שבו יהיה בגדר התא.</li>
	<li>בזהירות להסיר את הצינור לצנטריפוגה ולהעביר בעדינות את תגובת שיקוע עם פיפטה מזכוכית שפופרת פלסטיק ריק 15 מ"ל ישירות לאחר צנטריפוגה. הקפד להסיר את מרבית תגובת שיקוע אבל לטפל כדי למנוע איבוד בגדר תא (לעתים קרובות בלתי נראה) קטן.</li>
	<li>בזהירות resuspend בגדר תא ב- 50 – 100 µL L-15 תרבות בינוני. הערה: בשלב זה, זה ניתן לספור את התאים ו/או לבצע בדיקת הכדאיות (כגון תא ספירת בנוכחות trypan blue באמצעות של hemocytometer), אבל צריך להיזהר כי באמצעות חלק התליה תא למטרה זו תפחית את התשואה. הימנעו משימוש אמצעי אחסון גדול התלוי יגדיל את הסיכון של תאים לשדר מחוץ למרכז של המנה.</li>
	<li>לטפטף בזהירות את התאים dissociated באמצע המנה התרבות התא המכיל 2 מ"ל של המדיום L-15 (להכין בשלב 3.13). לאפשר את התאים לשקוע לתחתית של המנה כ 5 דקות לפני העברתם החממה, כדי להימנע מהצורך התאים התפשט אל מחוץ החלק השקוע של הזכוכית.</li>
	<li>דגירה המנה-26 ° C ו- 1% CO2 כדי לאפשר כל התאים לשקוע ביסודיות ולצרף לתחתית של המנה.</li>
	<li>לאחר 30 דקות, תראה התאים במיקרוסקופ כדי לוודא שהם צירפו לצלחת תרבות.</li>
	<li>להמשיך דגירה התאים-CO 26 ° C ו- 1%2.</li>
	<li>בקפידה לשנות רוב (אך לא כולם) של המדיום כל 3-4 ימים. הערה: הימנע שינוי המדיום בתדירות גבוהה יותר, כמו זה עשוי להפריע את התאים ולגרום להם לנתק מהתחתית זכוכית. השתמש התאים עבור ניסויים תוך שבוע לאחר זריעה אותם.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2010).</li><li>Ribeiro, L. P., Ahne, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+cell+culture:+initiation+of+a+line+of+pituitary+cells+from+carp+(Cyprinus+carpio)+to+study+the+release+of+gonadotropin+in+vitro.">Fish cell culture: initiation of a line of pituitary cells from carp (Cyprinus carpio) to study the release of gonadotropin in vitro.</a> In Vitro. 18 (5), 419-420 (1982).</li><li>Ribeiro, L., Ahne, W., Lichtenberg, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+normal+pituitary+cells+of+carp+(Cyprinus+carpio)+for+the+study+of+gonadotropin+release.">Primary culture of normal pituitary cells of carp (Cyprinus carpio) for the study of gonadotropin release.</a> In Vitro. 19 (1), 41-45 (1983).</li><li>Wong, A. O., Ng, S., Lee, E. K., Leung, R. C., Ho, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatostatin+inhibits+(d-Arg6,+Pro9-NEt)+salmon+gonadotropin-releasing+hormone-+and+dopamine+D1-stimulated+growth+hormone+release+from+perifused+pituitary+cells+of+chinese+grass+carp,+Ctenopharyngodon+idellus.">Somatostatin inhibits (d-Arg6, Pro9-NEt) salmon gonadotropin-releasing hormone- and dopamine D1-stimulated growth hormone release from perifused pituitary cells of chinese grass carp, Ctenopharyngodon idellus.</a> General and Comparative Endocrinology. 110 (1), 29-45 (1998).</li><li>Chang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+pituitary+cell+dispersion+method+and+primary+culture+system+for+the+studies+of+gonadotropin-releasing+hormone+action+in+the+goldfish,+Carassius+auratus.+I.+Initial+morphological,+static,+and+cell+column+perifusion+studies.">Use of a pituitary cell dispersion method and primary culture system for the studies of gonadotropin-releasing hormone action in the goldfish, Carassius auratus. I. Initial morphological, static, and cell column perifusion studies.</a> General and Comparative Endocrinology. 77 (2), 256-273 (1990).</li><li>Weil, C., Hansen, P., Hyam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+pituitary+cells+in+primary+culture+to+study+the+secretion+in+rainbow-trout+-+Setting+up+and+validating+the+system+as+assessed+by+its+responsiveness+to+mammalian+and+salmon+gonadotropin-releasing+hormone.">Use of pituitary cells in primary culture to study the secretion in rainbow-trout - Setting up and validating the system as assessed by its responsiveness to mammalian and salmon gonadotropin-releasing hormone.</a> General and Comparative Endocrinology. 62 (2), 202-209 (1986).</li><li>Montero, M., LeBelle, N., Vidal, B., Dufour, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+dispersed+pituitary+cells+from+estradiol-pretreated+female+silver+eels+(Anguilla+anguilla+L):+Immunocytochemical+characterization+of+gonadotropic+cells+and+stimulation+of+gonadotropin+release.">Primary cultures of dispersed pituitary cells from estradiol-pretreated female silver eels (Anguilla anguilla L): Immunocytochemical characterization of gonadotropic cells and stimulation of gonadotropin release.</a> General and Comparative Endocrinology. 104 (1), 103-115 (1996).</li><li>Xu, S. H., Cooke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-gated+currents+of+tilapia+prolactin+cells.">Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells.</a> General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).</li><li>Lin, S. W., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+gonadotropins+(FSH+and+LH)+and+growth+hormone+(GH)+by+neuroendocrine,+endocrine,+and+paracrine+factors+in+the+zebrafish-An+in+vitro+approach.">Differential regulation of gonadotropins (FSH and LH) and growth hormone (GH) by neuroendocrine, endocrine, and paracrine factors in the zebrafish-An in vitro approach.</a> General and Comparative Endocrinology. 160 (2), 183-193 (2009).</li><li>Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+conditions+for+primary+culture+of+pituitary+cells+from+the+Atlantic+cod+(Gadus+morhua).+The+importance+of+osmolality,+pCO2,+and+pH.">Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO2, and pH.</a> General and Comparative Endocrinology. 178 (2), 206-215 (2012).</li><li>Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka+-+a+model+organism+from+the+far+East.">Medaka - a model organism from the far East.</a> Nature Reviews Genetics. 3, 53-64 (2002).</li><li>Matsuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMY+is+a+Y-specific+DM-domain+gene+required+for+male+development+in+the+medaka+fish.">DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish.</a> Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).</li><li>Kasahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medaka+draft+genome+and+insights+into+vertebrate+genome+evolution.">The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution.</a> Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).</li><li>Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past+seawater+experience+enhances+seawater+adaptability+in+medaka,+Oryzias+latipes.">Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes.</a> Zoological Letters. 2 (12), (2016).</li><li>Waymouth, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmolality+of+mammalian+blood+and+of+media+for+culture+of+mammalian+cells.">Osmolality of mammalian blood and of media for culture of mammalian cells.</a> In Vitro. 6 (2), 109-127 (1970).</li><li>Cameron, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+homeostasis+-+past+and+present+perspectives.">Acid-base homeostasis - past and present perspectives.</a> Physiological Zoology. 62 (4), 845-865 (1989).</li><li>Claiborne, J. B., Edwards, S. L., Morrison-Shetlar, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+regulation+in+fishes:+cellular+and+molecular+mechanisms.">Acid-base regulation in fishes: cellular and molecular mechanisms.</a> Journal of Experimental Zoology. 293 (3), 302-319 (2002).</li><li>Perry, S. F., Tufts, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fish respiration. , (1998).</li><li>Hildahl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+tracing+of+luteinizing+hormone+&#946;-subunit+gene+expression+using+green+fluorescent+protein+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes)+reveals+a+putative+novel+developmental+function.">Developmental tracing of luteinizing hormone &#946;-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function.</a> Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).</li><li>Strandab&#248;, R. A. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+involved+in+GnRH2-stimulation+of+identified+LH-producing+gonadotropes+from+lhb-GFP+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes).">Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes).</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 372 (1-2), 128-139 (2013).</li><li>Verbalis, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+volume+regulation+in+response+to+changes+in+osmolality.">Brain volume regulation in response to changes in osmolality.</a> Neuroscience. 168 (4), 862-870 (2010).</li></ol>

המחברים יש ריהצהל.

במבחנה תא תרבות מערכות לספק כלים רבי-עוצמה עבור חוקרים לענות שפע של שאלות ביולוגיות שונות אם המשמשים את הדרך הנכונה1. חשוב לזכור כי התאים הפומבית איבדו את קשריהם עם התאים הסמוכים יתכן שהשגתם מאפיינים פונקציונליים שונים ממה שהיה להם במקור בתוך vivo. כדי להימנע להיות בס?...

תרבית תאים הוא אחד הכלים המרכזיים המשמשים למחקר ביולוגי מולקולרי, מספקת מערכת דגם מעולה עונה על שאלות ביולוגיות שונות ועד פיסיולוגיה תאית נורמלי סמים ההקרנה, carcinogenesis1. ראשי תאים, מבודד ישירות מן הרקמה החיה בשיטות אנזימטי ו/או מכני, לעיתים קרובות נחשבים יותר ביולוגית רלוונטית יותר שורות תאים כמו התגובה הביולוגי עשוי להיות קרוב יותר למצב ויוו . צריך להיות מוטבת פרוטוקולים עבור הכנת תרביות תאים הראשי עבור כל סוג מינים ותא של הריבית על מנת לחקות את המאפיינים אשר תא הוא מותאם, להשיג תוצאות משמעותיות מבחינה פיזיולוגית.
פרוטוקולים רבים מתארים תרבות התנאים עבור מערכות בתרבית של תאים, בעוד פרוטוקולים דומה המתארים התרבות העיקרית תנאים תאי דגים נדירים למדי בהשוואה. התאים הם פגיעים השינויים המהירים טמפרטורה, pH ו osmolality ולאחר חלשים במיוחד במהלך ההליך דיסוציאציה. פתרונות מלח מסחרי ומדיה תרבות המשמש בתרבית של תאים מהונדסים אינן מיטביות עבור דג teleost, במיוחד מבחינת מערכות מאגר pH osmolality. חשוב, לכן למדוד ולהתאים את הפתרונות לרמות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של פרמטרים אלה בהמינים של ריבית.
תרבויות יותרת המוח הראשי נעשו מתוך מספר teleost מיני דגים קרפיון מצוי (קרפיון carpio)2,3, דשא קרפיון (לאדלה Ctenopharyngodon)4, דג זהב (קרסיוס לדייק )5, פורל הקשת (Oncorhynchus mykiss)6, צלופח האירופית (אנגווילה אנגווילה)7, אמנון (Oreochromis mossambicus)8, דג זברה (רזבורה rerio)9, ו בקלה האוקיינוס האטלנטי (Gadus morhua)10. מלבד התאמת הטמפרטורה הדגירה המינים עניין, מספר פרוטוקולים אלה יש מודגרות התאים-מידע יונקים דמויי תנאים שעשויים להיות שיוצרת עבור המינים של עניין, עם pH מ- 7.2 7.5 באווירה humidified המכילה 3-5% CO2. בנוסף, זה לא ברור אם osmolality של פתרונות משתמשים להכנת מספר תרבויות התא הראשי אלה הותאמו ויציב בין פתרונות שונים.
בפרוטוקול הנוכחי מבוסס על העבודות הקודמות עם ראשי תרבויות בקלה האוקיינוס האטלנטי10 , ומורכב התאמות בטמפרטורת דגירה, osmolality, ה-pH pH מאגר מערכות, כולל את לחץ חלקי של פחמן דו חמצני (pCO2), כדי הפיזיולוגיה של medaka (O. latipes). Medaka הוא קטן (3-4 ס מ) דג של מים מתוקים, ילידי מזרח אסיה. בימים אלה, הוא משמש כמין מודל במעבדות מחקר רבים ברחבי העולם, כפי שהוא קל יחסית להתרבות, עמידים מאוד בפני רבים נפוצים דגים מחלות11. ישנם מספר יתרונות השימוש medaka כמודל, כולל עמידות בטמפרטורה של 4 – 40 ° C11, זמן דור קצר, העוברים שקוף, עם קביעת מין ג'ין12, קובצי רצף הגנום של13, וכן רבים אחרים זמינות משאבים גנטי.
תנאי התרבות העיקרי פרוטוקול זה המותאמים בצורה מיטבית כדי להתאים את הטמפרטורה של 26 ° C זה medakas נשמרים במתקן דגים. עוד יותר, osmolality מצומצמת מ- 320 mOsm/kg של בקלה האוקיינוס האטלנטי חי במים מלוחים עד 290 mOsm/kg במשך medaka לחיות במים מתוקים והוא בהתאם osmolality נורמלי של פלזמה medaka14. לשם השוואה, osmolality טיפוסי של פלסמה יונקים הוא בטווח של 275 – 295 mOsm15. הדג במגוון רחב של טמפרטורות ויש הזימים הנמצאים במגע ישיר עם המים, לעשות את יכולת ה-pH ומאגר של הדם, נוזל חוץ-תאי דגים שונים מאלה ביונקים. בתרבית של תרבות התקשורת כוללים בדרך כלל מערכות מאגר שתוצאתה pH של בסביבות 7.4 כאשר התקשורת הם equilibrated לאווירת רגיל של 5% CO2 באוויר humidified ב 37 º C. ה-pH הוא הטמפרטורה תלוי הערך עבור ה-pH נייטרלי (במים) עולה עם הטמפרטורה יורדת16. טיפוסי דגים teleost פלזמה pH נע בין 7.7 7.917. אופטימיזציה של פרוטוקול זה כללה ירידה מ- pH 7.85 בקלה שמרו ב 12 ° C ל pH 7.75 medaka המשיך בטמפרטורה 26 ° C על ידי הגדלת CO2 מ- 0.5% ל 1%.
בנוסף, היכולת מאגר ביקרבונט שונה לגמרי של דגים, יונקים. CO2 בקלות חילופי מעל הגג בדגים, ה pCO2 במים רק חלק קטן של pCO2 ב- ריאות18. שינוי הטמפרטורה או ה pCO2 תשנה את ה-pH ואת מאגר של המדיום. כתוצאה מכך, ה-pH וגם ה pCO2 מומלצת המקננת בתרבית של תאים הוא אופטימלי תאי דגים, לכן, התקשורת התרבות ניתן למטב במערכות מאגר המכיל ערכים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית דגים ו מינים מסוימים של עניין. פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין התא הראשי של medaka pituitaries תרבויות, כוללים התאמות של דגירה טמפרטורה, osmolality, pH ו- pH מאגר מערכת, בנוסף אחרים פרמטרים חשובים שיש לקחת בחשבון בעת הכנת התא הראשי תרבויות ממינים מידע שאינם יונקים.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>D8537</td><td>Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol.</td></tr><tr><td>L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>L5520</td><td>Supplement 500 ml culture medium with 10 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 &amp;micro;m PES sterile filter, before adding 2.5 mL Penicillin-Streptomycin solution (see below for details).</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>S5881</td><td>Add drops of 1 M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75.</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>S5761</td><td>10 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; equals 420 mg per 500 mL culture medium.</td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>63565</td><td>Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm.</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>G5400</td><td>4.5 mM&amp;nbsp; D-glucose equals 405 mg per 500 mL culture medium.</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco (Life Technologies, Paisley, UK)</td><td>35050-061</td><td>Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100x stock in 500 mL culture medium.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>P0781</td><td>Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 mL of stock solution in 500 mL L-15 medium (equivalent of 50 U/mL Penicillin and 50 &amp;micro;g/mL Streptomycin).</td></tr><tr><td>Trypsin type II-S</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>T7409</td><td>Prepare 1 mg/mL in dPBS solution.</td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor type I-S</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>T6522</td><td>Prepare 1 mg/mL in dPBS solution, supplement with 2 &amp;micro;g/ml Dnase I (see details below).</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>D5025</td><td>Use in trypsin inhibitor solution (see above).</td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m Polyethersulfone (PES) sterile filter system</td><td>Corning Inc. (Corning, NY)</td><td>431097</td><td>Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments.</td></tr><tr><td>35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated</td><td>MatTek Corporation (Ashland, MA)</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td>Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application.</td></tr><tr><td>Dumont #5 fine forceps</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>11254-20</td><td>Straight tip</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 fine forceps</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>11253-25</td><td>Angled 45&amp;deg; tip</td></tr><tr><td>Stereo microscope SZ61</td><td>Olympus Corp. (Tokyo, Japan)</td><td></td><td>Use for dissection of pituitaries.</td></tr><tr><td>Alegra X-22R Centrufuge</td><td>Beckman Coulter Inc. (Brea, CA)</td><td></td><td>With cooling option (similar to current model XR-30).</td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Techne (Staffordshire, UK)</td><td></td><td>Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do.</td></tr><tr><td>Pasteur glass pipettes</td><td>VWR (NY)</td><td>612-1701</td><td>Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use.</td></tr><tr><td>Galaxy MiniStar table centrifuge</td><td>VWR (NY)</td><td>521-2844</td><td>Any small table centrigue will do.</td></tr><tr><td>Fine needles/insect pins</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>26001-40</td><td>Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead.</td></tr><tr><td>Wax plate</td><td></td><td></td><td>Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish.</td></tr></tbody></table>

preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries

התרבות התא העיקרי הוא כלי רב עוצמה בשימוש נפוץ על ידי מדענים לחקור מנגנונים של תאים מבודדים בסביבה מבוקרת ולמאפיינים הסלולר. למרות השוני העצום פיזיולוגי בין יונקים ודגים, התא הראשי תרבות פרוטוקולים דגים מבוססים לעתים קרובות על תנאים בתרבית של תרבות, לעיתים קרובות עם שינויים מזעריים בלבד. ההבדלים סביבתיים משפיעים על טמפרטורת הגוף אלא גם נסיוב הדם פרמטרים כגון osmolality, ה-pH pH מאגר קיבולת. תא תרבות המדיה ופתרונות עבודה דומה נועדו לחקות את מאפייני נוזל חוץ-תאי ו/או בסרום הדם אשר תא הוא מותאם, זה חיוני כי פרמטרים אלו מותאמות במיוחד כדי בבעל.
בפרוטוקול הנוכחי מתאר תנאים אופטימליים תרבות ראשי medaka (Oryzias latipes). הפרוטוקול מספק שלבים מפורטים כיצד לבודד ולתחזק בריא הפומבית תאים יותרת המוח במשך יותר משבוע, כולל את השלבים הבאים: 1. התאמת osmolality על הערכים שנמצאו פלזמה דם medaka, 2. התאמת בטמפרטורת דגירה לטמפרטורת medaka רגיל (כאן במתקן aquarium), ו-3. ההתאמה של מאגר ה-pH של ביקרבונט לערכים להשוות מינים אחרים של דגים חיים בטמפרטורה דומה. התוצאות שהוצגו באמצעות פרוטוקול המתואר לקדם תוצאות משמעותיות מבחינה פיזיולוגית medaka, יכול לשמש כמדריך הפניה על ידי מדענים ביצוע תרביות תאים ראשי ממינים אחרים שאינם מידע יונקים.

פרוטוקול זה מתאר את הכנת תרבות התא הראשי של medaka pituitaries ומספק תאים בריאים זה יכול להישמר בתרבות לפחות אחת לשבוע. הפרוטוקול מבוסס על הערכים הרלוונטיים פיזיולוגיים medaka14 , בנוסף ממוטבת כדי רקמת יותרת המוח בדגים הבוגרים, באמצעות pH של 7.75 של osmolality של mOsm 290/ק"ג במהלך ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries at JoVE.com

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

כאן נתאר פרוטוקול להכין ולשמור על תרביות תאים יותרת המוח הראשי של medaka (Oryzias latipes). תנאי ממוטבת פרוטוקול זה להתחשב פרמטרים חשובים כגון טמפרטורה, osmolality ו- pH מאת לחקות את התנאים הפיזיולוגיים של הדג, ובעקבותיו פיזיולוגית משמעותי יותר תוצאות.

הכנה של תרבות התא העיקרי באיכות גבוהה של דגים Pituitaries

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

preparation-high-quality-primary-cell-culture-from-fish

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K Views.  Norwegian University of Life Sciences. כאן נתאר פרוטוקול להכין ולשמור על תרביות תאים יותרת המוח הראשי של medaka (Oryzias latipes). תנאי ממוטבת פרוטוקול זה להתחשב פרמטרים חשובים כגון טמפרטורה, osmolality ו- pH מאת לחקות את התנאים הפיזיולוגיים של הדג, ובעקבותיו פיזיולוגית משמעותי יותר תוצאות.

Video: Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

תרבות, תרביות תאים תאים ראשי דג זברה

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Developmental Biology

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Biology

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

תלת ממד תרבות אלגינט חרוז של תאי אדנומה יותרת המוח האנושי

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Medicine

Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the clear majority have been performed on dissociated primary cells. To improve our understanding of how teleost pituitary cells, behave in a more biologically relevant environment, this protocol shows how to prepare viable brain-pituitary slices using the small freshwater fish medaka (Oryzias latipes). Making the brain-pituitary slices, pH and osmolality of all solutions were adjusted to values found in body fluids of freshwater fish living at 25 to 28 &#176;C. Following slice preparation, the protocol demonstrates how to conduct electrophysiological recordings using the perforated whole-cell patch-clamp technique. The patch-clamp technique is a powerful tool with unprecedented temporal resolution and sensitivity, allowing investigation of electrical properties from intact whole cells down to single ion channels. Perforated patch is unique in that it keeps the intracellular environment intact preventing regulatory elements in the cytosol from being diluted by the patch pipette electrode solution. In contrast, when performing traditional whole-cell recordings, it was observed that medaka pituitary cells quickly lose their ability to fire action potentials. Among the various perforation techniques available, this protocol demonstrates how to achieve perforation of the patched membrane using the fungicide Amphotericin B.

The article describes an optimized protocol for making viable brain-pituitary tissue slices, using the teleost fish medaka (Oryzias latipes), followed by electrophysiological recordings of pituitary cells using the patch-clamp technique with the perforated patch configuration.

פרוסות המוח, יותרת המוח בריא לחקירות אלקטרופיזיולוגיות של תאים יותרת המוח בדגים Teleost

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

התא הראשי תרבות של מטוהרים GABAergic או Glutamatergic נוירונים הוקמה באמצעות מיון תאים פלואורסצנטית מופעל

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

הכנת תא / תרבויות והיצמדות למנגנון הראשי myogenic מבשר משושלות חוליות בסל

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

שיטת אלקטרופורמציה יעילה וחסכונית לחקר מסלולי איתות ראשוניים תלויי סיליום במבשר תאי הגרגיר

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

תרבית ראשונית של תאי אפיתל פיגמנט רשתית חזירית

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The preparation of high-quality single-cell suspensions is essential for single-cell level studies such as single-cell RNA or genome sequencing. However, there is no ready-to-use protocol for aquaculture fish species, particularly for the intestine of tilapia. The effective dissociation enzymes vary depending on the tissue type. Therefore, optimizing the tissue dissociation protocol by selecting the appropriate enzyme or enzyme combination to obtain enough viable cells with minimum damage is essential. This study illustrates an optimized protocol to prepare a high-quality single-cell suspension from Nile tilapia intestine with an enzyme combination of collagenase/dispase. This combination is highly effective for dissociation with the utilization of bovine serum albumin and DNase to reduce cell aggregation after digestion. The cell output satisfies the requirements for single-cell sequencing, with 90% cell viability and a high cell concentration. This protocol can also be modified to prepare a single-cell suspension from the intestines of other fish species. This research provides an efficient reference protocol and reduces the need for additional trials in the preparation of single-cell suspensions for aquaculture fish species.

Here, we demonstrate the preparation of a high-quality single-cell suspension of tilapia intestine for single-cell sequencing.

הכנת תרחיף חד-תאי ממעי אמנון הנילוס לריצוף חד-תאי

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Generation of Primary Retinal Ganglion Cell Cultures From Zebrafish Embryos

Source: Terzi, A., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/62165">ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development.</a> J. Vis. Exp. (2021)
The video demonstrates a method for culturing primary retinal ganglion cells from zebrafish embryos. Early-stage embryos undergo dissection to isolate the eyes, which are subsequently mechanically dissociated into a suspension of retinal ganglion cells. This cell suspension is cultured on coverslips coated with adhesive proteins to facilitate axon development.

יצירת תרביות תאי גנגליון רשתית ראשוניים מעוברי דגי זברה

1. Preparation of solutions

	E2 media (1x)
	
		Prepare 100x E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) and 500x E2C (100 mL) solutions by combining all components ...