Name: corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing
Uploaded: 2018-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing at JoVE.com

ברצוננו להודות Ikkala קאיזה שלה בפז סיוע טכני, תובנה עזרה בעת שמצדדי בשיטה זו, כמו גם בהמשך במהלך הביצוע שלנו שאלות מחקר מרכזי. אנחנו גם רוצה להודות לה עזרה בתכנון הקווים המנחים של העבודה וטרינרית מעבדה חיה במרכז, אנה מלר.

כל ניסויים אושרו על ידי מועצת המנהלים הלאומית ניסויים בבעלי חיים.
1. תכשירים
<ol><li>להכין את כל הפתרונות ולשמור בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת. עקוב אחר כללי סילוק פסולת חומרים השלך בשימוש ופתרונות.</li>
	<li>שימוש NMRI ו- ICR outbred מניות, בין הגילאים 4-12 שבועות או מגדר. אם משתמש המתח C57BL/6, בצע את שיטת ההכנה של קטמין-medetomidine בשלב 1.3.2. לקבלת צעדים נוספים, בצע את ההוראות המתוארות 1.3.3.-1.3.5.</li>
	<li>הכינו את רפואה וטרינרית טרי, בזמן לפני תחילת הפעולה. Carprofen ייעשה שימוש מאוחר יותר, ולכן זה לא הכרחי להכין אותו בשלב זה.<ol>
<li>כדי להתכונן פתרון של קטמין-medetomidine הרדמה, לערבב 0.375 mL (במניה ריכוז 50 מ"ג/מ"ל) של קטמין (Ketaminol וטרינר) עם 0.25 mL (במניה ריכוז 1 מ"ג/מ"ל) של medetomidine (Cepetor וטרינר) ולהוסיף 1.25 מ ל סטרילי 0.9% NaCl. לנהל 0.15 מ ל/20 גרם של משקל העכבר (7.5 מ"ג/ק"ג, קטמין, 1 מ"ג/ק"ג, medetomidine).</li>
		<li>כדי להתכונן פתרון ובדילול של קטמין-medetomidine הרדמה על עכברים C57BL/6, לערבב 0.375 mL (במניה ריכוז 50 מ"ג/מ"ל) של קטמין עם 0.25 mL (במניה ריכוז 1 מ"ג/מ"ל) של medetomidine ולהוסיף 2.5 מ של סטרילי 0.9% NaCl. לנהל 0.15 מ ל/20 גרם של משקל העכבר (3.75 מ"ג/ק"ג, קטמין ו- 0.5 מ"ג/ק"ג, medetomidine). הערה: זהו שלב חלופיים, רק עבור עכברים C57BL/6 למבוגרים.</li>
		<li>כדי להתכונן buprenorfin נגד כאבים, להוסיף 0.1 מ"ל (במניה ריכוז 0.3 מ"ג/מ"ל) של buprenorfin מ ל 1.9 של סטרילי 0.9% NaCl. לנהל 0.2 מ"ל/20 g העכבר משקל (0.15 מ"ג/ק"ג).</li>
		<li>כדי להכין atipamezole להפסקת הרדמה, להוסיף 0.1 מ"ל (במניה ריכוז 5 מ"ג/מ"ל) של atipamezole 4.9 מ של 0.9% NaCl. לנהל 0.15 מ ל/20 g העכבר משקל (0.75 מ ג/ק ג).</li>
		<li>לשימוש נגד כאבים במהלך פוסט-הרדמה carprofen. להוסיף 0.1 מ"ל (במניה ריכוז 50 מ"ג/מ"ל) של carprofen 4.9 מ של 0.9% NaCl. לנהל 0.15 מ ל/20 גרם של משקל העכבר (7.5 מ"ג/ק"ג).</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין פתרון מכתימים פלורסנט<ol>
<li>המדגימה את השריטה תחת אור כחול קובלט (איור 1), להשתמש פתרון פלורסנט. להכין פתרון fluorescein 0.1% על-ידי הראשון מדידה 10 מ ג של fluorescein מלח עם קנה מידה בסדר ולאחר מכן להוסיף אותה 10 מ ל תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS).</li>
		<li>על הפתרון fluorescein מפני אור ומנערים למשך 5 דקות על מטרף. הערה: הפתרון fluorescein הוא רגישים לאור; שמור את הפתרון מכוסה אור. פתרון זה ניתן לאחסן +4 ° C 2-3 ימים. לשימוש, זה עוזר למקם את הפתרון fluorescein בבקבוק טפי המשמשת עבור טיפות עיניים. השתמש במסנן-סטריליים בעת העברת הפתרון של הבקבוק טפי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לנקות את הטיפ עינית burr לפני ואחרי השימוש; בהתחלה עם PBS ולאחר מכן עם 70% EtOH. אם עושה שחיקה של מספר עכברים במהלך הפעולה זהה, לעשות את השלבים ניקוי בין כל עכבר.</li>
	<li>לשים את הצלחת מחוממת (+37 ° C) ומניחים מגבת נייר על זה.</li>
</ol>2. שחיקה הקרנית
התראה: שימוש מגן ללבוש (כפפות, חלוק המעבדה) כאשר טיפול עכברים. שוקלים את העכבר כדי להעריך את עוצמת הקול של תרופות כדי לנהל.
<ol><li>השתמש בשיטת scruffing עם יד אחת כדי להתמודד עם העכבר23. לנהל את התערובת קטמין-medetomidine intraperitoneally (i.p.) אל הבטן התחתונה השמאלית. הנח את העכבר לכלוב הפרט ולחכות לו להירדם. זה בדרך כלל לוקח פחות מ-5 דקות. לאחר מכן, לנהל buprenorfin הראשון ולאחר מכן atipamezole ויה i.p. זריקות. השתמש באותה שיטה טיפול. הערה: לאחר ההרדמה ניתנת, הפרוטוקול צריך לא ניתן להשהות בכל רגע.</li>
	<li>לפני שתמשיך, ודא לצלחת מחוממת חמים. הנח את העכבר anesthetized בצלחת מחוממת. הרמה של הרדמה היא טובה אם רפלקס הזנב נעדר, אך רפלקס הבוהן קיים. בדוק את הרפלקסים הללו על ידי צובט את הזנב ואת כל הבוהן עם אצבעות או מלקחיים. אל תשתמש בכוח מופרז. הרדמה יהיה האחרון 20-25 דקות.</li>
	<li>כדי להפוך של שחיקה, השתמש את burr עינית נקי. לסובב את בסיס burr כדי להפעיל את הרטט זה חיוני כדי להפוך את השריטה. מרגיש את הרטט ביד, כאשר burr מתפקד כראוי.<ol>
<li>פתח עין אחת בכל פעם על-ידי החזקת העפעפיים בנפרד עם האצבעות. לאחר מכן בחוזקה לגעת את burr בקרנית, לזוז אחורה וקדימה גם המכשיר כמו הצדה על פני עינית. הרטט burr יבצע השריטה; לא ללחוץ, ללחוץ או לקרוע את הקרנית. הקרנית המרכזית, 20 ששרט תנועות על פני השטח הם מספיק כדי לגרום את הפצע. לא להרים את burr ולנסות להישאר באזור של הקרנית כדי להיות שפשף בכוח. רכישת שחיקה בגודל סטנדרטי ידרוש מספר מחזורים של תרגול.</li>
	</ol>
 הערה: asepsis המצמוץ יכולה להיות מושגת לפני שחיקה באמצעות פתרון אופטלמולוגיות betadine.</li>
</ol>3. הדמיה של שחיקה
<ol><li>להאיר את האזור משופשפים באמצעות האור עט כחול קובלט (איור 1) ו- fluorescein פתרון. השטח עינית מופיע צבע אור הסביבה. לאחר יישום fluorescein, האזור משופשפים שזוהר בירוק כאשר מאירים את העין בעזרת העט אור.<ol>
<li>אם יש צורך, לפתוח את העין משופשפים באופן דומה כמו 2.3 ולפקח טיפה אחת של fluorescein פתרון מהבקבוק טפי. לשטוף את העיניים פעם אחת עם PBS או 0.9% NaCl כדי להפחית את הרקע של fluorescein. השתמש בקבוק טפי או פיפטה לרחצה. וארוקן את הנוזלים משם עם מגבון רך ולנקות את הריסים, במידת הצורך. הנוזל העודף אוספת בדרך כלל על הגבול האף של העין, ליד הפתח של תעלת דמעות. התראה: להימנע מלגעת הקרנית בזמן cleaining כמו שריטות קלות עלול להיגרם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לצלם שחיקה הקרנית.<ol>
<li>כדי לקבל תמונות דומות בכל מפגש הדמיה, להשתמש בכלים מצורף יציב האור עט כחול קובלט, מצלמות slr דיגיטליות (איור 2). פרוטוקול זה מספק התקנה קלה לחזור (איור 2).<ol>
<li>כדי לצרף את האור עט ואת המצלמה, השתמש מנורת שולחן עם זרוע גמישה, מלחציים, זרוע מתכווננת מצלמה עם מלחציים, בהתאמה. אזיקון אור מנורת שולחן, עמדה מעל העין העכבר? העט. מיצוב האור אחרת עלולה לשנות את החזיית השריטה. הצעה עבור מיקום כלים אלה מתוארת באיור2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להשתמש מצלמות slr דיגיטליות לצלם תמונות של העין. מקום בעל החיים המרחק הרצוי ומעמד מיקוד המצלמה (1:12) חדר אור. לאחר מכן, סגור את כל האורות האחרים מלבד האור עט כחול קובלט. הערה: קלטת הידית האור עט למטה או השתמש גומייה כדי להשאיר את האור דולק כל הזמן במהלך דימות. זה יכול לעזור אם התמונה הופכת להיות מטושטש. . זה קל יותר לבצע את הצעד הדמיה עם עמית.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. להתעורר לאחר שחיקה הקרנית
<ol><li>לנהל buprenorfin הראשון ולאחר מכן atipamezole ויה i.p. זריקות. השתמש באותה שיטה טיפול כמו 2.1.</li>
	<li>הניחו טיפת, fucidin העין חומצה פלסטר (Isathal) לעיניים משופשפים והן שפשף בכוח ללא לחות ולשמור על פני עינית נקי מחיידקים לאחר הרדמה.</li>
	<li>כמו העכבר יתעורר בעוד 5-20 דקות בצלחת מחוממת, להתבונן בעכבר במהלך התקופה שלאחר הרדמה השכמה. כאשר זה הופך ניידים, למקם אותו לכלוב נפרד. הערה: אם מתעורר לוקח יותר זמן, הנח את העכבר בתוך הכלוב עם כרית מחוממת או למקם את הכלוב כולו על הצלחת מחוממת, לפקח על העכבר באופן קבוע. בזמן ההרדמה מתנדף, העכבר בדרך כלל מנערת, מגיע כלפי מעלה עם הגוף הקדמי. אופן פעולה זה יחזור להיות נורמאלי ב 3-4 שעות, ואז ניתן למקם את העכבר בחזרה אל כלוב משותפים.</li>
	<li>לנהל carprofen i.p. לקבלת משחה נגד כאבים ועין בשני ימים עוקבים אחרי השריטה, באופן דומה כמו צעדים 2.2. 4.2.</li>
</ol>5. דימות במהלך ריפוי הפצע
<ol><li>ב פרוטוקול זה, זמן שימוש הנקודות 18 h ו- 72 h לאחר שחיקה להתבונן על סגירת הפצע.<ol>
<li>עבור הדמיה רצופים, עזים ומתנגד העכברים כפי שהוסבר ב 2.2.</li>
		<li>צלם תמונות כפי שהוסבר ב 3.</li>
		<li>תתעורר של בעלי חיים atipamezole i.p. ונטר תקופת התעוררות כפי שהוסבר ב- 4.3. הערה: אם לא ממשיכים את המעקב, המתת חסד העכבר מיד אחרי 5.1.2. המתת חסד מתואר ב- 6.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. קרנית אוסף והטבעה פרפין
<ol><li>לאחר הנקודה בזמן האחרון, להקריב את החיה. הנח את העכבר בחדר זה יכול להיות מלא עם CO2. למלא את האוויר קאמרית עם CO2- כאשר החיה משותק, לנקוע חוליות צוואר הרחם על ידי מושך בחוזקה מבסיס של הזנב והקשה על אזור הצוואר למטה באותו הזמן. התראה: תמיד את ההנחיות של הגוף רווחת בעלי חיים מקומיים.</li>
	<li>לאסוף את כל גלגל העין על ידי חיתוך פתח בעור לצד של העין במספריים לנתיחה. מקם את המספריים תחת גלגל העין וחותכים העצב עינית כדי לפוצץ את גלגל העין מתוך המסלול. להשתמש מלקחיים אם העין לא יצא בקלות.<ol>
<li>תעשה חור בחלק האחורי של העין, בצד ברשתית, עם מחט 26G כדי לאפשר חדירה חינם של פתרונות בתוך העין. הערה: אל תתנו את העין להיות יבש, במקום זאת, נזכרתי ב- PBS עד שתמשיך עם הפרוטוקול.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאסוף את גלגל העין צינור 2 מ"ל עם PBS. אל תשתהה בנקודה הזאת מהניסוי.</li>
	<li>הסר PBS, לתקן את העיניים ב 4% paraformaldehyde (PFA) +4 º C למשך 4-5 שעות.</li>
	<li>להעביר את גלגל העין קבוע קלטת רקמות לצורך עיבוד רקמה. השתמש בממחטה עיבוד מחשב לבין התוכנית הבאה:<ol>
<li>לשטוף עם PBS.</li>
		<li>דגירה 2 x 45 דקות ב- 70% אתנול בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>דגירה 2 x 1 h ב- 94% אתנול בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>דגירה 3 x 45 דקות באתנול מוחלטת בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>דגירה 3 x 1 h, קסילן, בטמפרטורת החדר, קסילן האחרון ב 37 º C.</li>
		<li>דגירה 3 x 1 h בפרפין ב 60 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר עיבוד רקמה, להטביע את גלגל העין לתוך שמן פראפין (+ 60 ° C) באמצעות בלוק ההטבעה רקמות. המקום העין בתוך הרחוב כך זה נראה מהצד, הגבול היקפיים פונה כלפי מעלה. תן את הבלוק לחזק על צלחת מגניב במשך 5-10 דקות.</li>
</ol>7. פרפין מקטעים של הקרנית
<ol><li>הכינו את האזמל הקטן על חלוקתה לפי ההוראות של מוסד או של היצרן. התראה: להיות זהיר בעת טיפול הלהב מיקרוטום חדה.</li>
	<li>המקום אמבט מים אחד עם מים בטמפרטורת החדר הנדסה גנטית לצד האזמל הקטן ועוד עם הנדסה גנטית מים מחומם ל +50 ° C.</li>
	<li>הפוך את 5 מיקרומטר. הסעיפים עבה של גלגל העין. הערה: העדשה מעברי בקלות במהלך חלוקתה. כדי למנוע זאת, לנגב את המשטח עם ממחטה לחה בכל שורה חדשה של מקטעים מופעל. להשתמש במי ברז כדי להרטיב את הרקמה.</li>
	<li>במקום הסעיפים לצד השני באמבט מים בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להעביר אותם אמבט מים חמים עם העזרה של זכוכית. למתוח את הסעיפים לאמבט מים חמים עד כל הקמטים להירגע, צבע המאט מקטעים להפוך.</li>
	<li>יבש את השקופיות זכוכית עם מקטעים לילה ב- +37 ° C.</li>
	<li>לצרף את המקטעים השקופיות על ידי שמירה על השקופית במשך דקה אחת על צלחת מחוממת ב +60 ° C. אחרי זה, הסעיפים ניתן ישירות מעובד עבור צביעת, שיטות immunohistological או מאוחסנים +4 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yi, X., Wang, Y., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+tight+junctions+and+their+response+to+lipopolysaccharide+challenge.">Corneal epithelial tight junctions and their response to lipopolysaccharide challenge.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 41 (13), 4093-4100 (2000).</li><li>Wang, Y., Chen, M., Wolosin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZO-1+In+Corneal+Epithelium;+Stratal+Distribution+and+Synthesis+Induction+by+Outer+Cell+Removal.">ZO-1 In Corneal Epithelium; Stratal Distribution and Synthesis Induction by Outer Cell Removal.</a> Experimental Eye Research. 57 (3), 283-292 (1993).</li><li>Sugrue, S. P., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZO1+in+Corneal+Epithelium:+Association+to+the+Zonula+Occludens+and+Adherens+Junctions.">ZO1 in Corneal Epithelium: Association to the Zonula Occludens and Adherens Junctions.</a> Experimental Eye Research. 64 (1), 11-20 (1997).</li><li>Jackson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+eye-pads+on+healing+of+simple+corneal+abrasions.">Effect of eye-pads on healing of simple corneal abrasions.</a> British Medical Journal. 2 (5200), 713 (1960).</li><li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals.">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).</li><li>Kalha, S., Shrestha, B., Sanz Navarro, M., Jones, K. B., Klein, O. D., Michon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1++Progenitor+Cell+Dynamics+in+Murine+Cornea+During+Homeostasis+and+Wound+Healing.">Bmi1+ Progenitor Cell Dynamics in Murine Cornea During Homeostasis and Wound Healing.</a> Stem Cells. , (2018).</li><li>Nasser, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal-Committed+Cells+Restore+the+Stem+Cell+Pool+and+Tissue+Boundary+following+Injury.">Corneal-Committed Cells Restore the Stem Cell Pool and Tissue Boundary following Injury.</a> Cell Reports. 22 (2), 323-331 (2018).</li><li>Kaplan, N., Fatima, A., Peng, H., Bryar, P. J., Lavker, R. M., Getsios, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA2/Ephrin-A1+Signaling+Complexes+Restrict+Corneal+Epithelial+Cell+Migration.">EphA2/Ephrin-A1 Signaling Complexes Restrict Corneal Epithelial Cell Migration.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (2), 936 (2012).</li><li>Bai, J. -. Q., Qin, H. -. F., Zhao, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+on+mouse+model+of+grade+II+corneal+alkali+burn.">Research on mouse model of grade II corneal alkali burn.</a> International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).</li><li>Chan, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+matrix+metalloproteinase-12+following+corneal+injury.">Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury.</a> Journal of Cell Science. 126, 3948-3960 (2013).</li><li>Byeseda, S. E., Burns, A. R., Dieffenbaugher, S., Rumbaut, R. E., Smith, C. W., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1+is+necessary+for+epithelial+recruitment+of+gammadelta+T+cells+and+efficient+corneal+wound+healing.">ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of gammadelta T cells and efficient corneal wound healing.</a> American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).</li><li>Amitai-Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Lineage+Tracing+of+Corneal+Cells+Using+Multi-color+Fluorescent+Reporter+Mice.">A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).</li><li>Amitai-Lange, A., Altshuler, A., Bubley, J., Dbayat, N., Tiosano, B., Shalom-Feuerstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+Tracing+of+Stem+and+Progenitor+Cells+of+the+Murine+Corneal+Epithelium.">Lineage Tracing of Stem and Progenitor Cells of the Murine Corneal Epithelium.</a> Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).</li><li>Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;V&#946;6+Integrin+Promotes+Corneal+Wound+Healing.">&#945;V&#946;6 Integrin Promotes Corneal Wound Healing.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 52 (11), 8505 (2011).</li><li>Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Thrombospondin-1+in+Repair+of+Penetrating+Corneal+Wounds.">Role of Thrombospondin-1 in Repair of Penetrating Corneal Wounds.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (9), 6262 (2013).</li><li>Gipson, I. K., Kiorpes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+sheet+movement:+Protein+and+glycoprotein+synthesis.">Epithelial sheet movement: Protein and glycoprotein synthesis.</a> Developmental Biology. 92 (1), 259-262 (1982).</li><li>Danjo, Y., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+&amp;#34;purse+string&amp;#34;+filaments+are+anchored+by+E-cadherin-mediated+adherens+junctions+at+the+leading+edge+of+the+epithelial+wound,+providing+coordinated+cell+movement.">Actin &amp;#34;purse string&amp;#34; filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement.</a> Journal of Cell Science. 111, 3323-3332 (1998).</li><li>Lyu, J., Joo, C. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt-7a+up-regulates+matrix+metalloproteinase-12+expression+and+promotes+cell+proliferation+in+corneal+epithelial+cells+during+wound+healing.">Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21653-21660 (2005).</li><li>Nagata, M., Nakamura, T., Hata, Y., Yamaguchi, S., Kaku, T., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBP485+promotes+corneal+epithelial+wound+healing.">JBP485 promotes corneal epithelial wound healing.</a> Science Reports. 5, 14776 (2015).</li><li>Stepp, M. A., Zhu, L., Cranfill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+beta+4+integrin+expression+and+localization+in+vivo+in+response+to+corneal+epithelial+injury.">Changes in beta 4 integrin expression and localization in vivo in response to corneal epithelial injury.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 37 (8), 1593-1601 (1996).</li><li>Stepp, M. A., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+alpha+9+integrin+and+tenascin+during+epithelial+regeneration+after+debridement+in+the+cornea.">Upregulation of alpha 9 integrin and tenascin during epithelial regeneration after debridement in the cornea.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 45 (2), 189-201 (1997).</li><li>Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BALB/c+and+C57BL6+mouse+strains+vary+in+their+ability+to+heal+corneal+epithelial+debridement+wounds.">BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds.</a> Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).</li><li>. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques Available from: <a target="_blank" href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques">https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques</a> (2018)</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+the+basement+membrane+enhances+corneal+wound+healing.">Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).</li><li>Suzuki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-matrix+and+cell-cell+interactions+during+corneal+epithelial+wound+healing.">Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).</li><li>Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+differences+between+FVB+and+C57BL/6+mice+affect+hypnotic+susceptibility+to+pentobarbital,+ketamine+and+nitrous+oxide,+but+not+isoflurane.">Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane.</a> Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).</li><li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K14+++Compound+niches+are+present+on+the+mouse+cornea+early+after+birth+and+expand+after+debridement+wounds.">K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds.</a> Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).</li><li>Boote, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Assessment+of+Ultrastructure+and+Light+Scatter+in+Mouse+Corneal+Debridement+Wounds.">Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).</li><li>Pal-Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP9+cleavage+of+the+&#946;4+integrin+ectodomain+leads+to+recurrent+epithelial+erosions+in+mice.">MMP9 cleavage of the &#946;4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+the+study+of+recurrent+corneal+epithelial+erosions:+alpha9beta1+integrin+implicated+in+progression+of+the+disease.">A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

שיטות ופצעו הם כלים פופולריים ללמוד היבטים שונים של הומאוסטזיס הקרנית, פתולוגיות. המודל שחיקה מציע שיטה ומבוקרות היטב כדי לטפל בבעיות רלוונטיות עיניים. עם זאת, נקודות קריטיות מסוימות בפרוטוקול שווים תוך שימת דגש. ראוי לציין, הפרטים המפורטים לגבי רפואה וטרינרית, ציר זמן ריפוי הפצע, ו התוצא?...

שכבות אפיתל של איברים רבים נחשפים לפציעות. עם זאת, הם גם מכילים את היכולת לפצות על אובדן הרקמות דרך ריפוי הפצע. הקרנית מציע מודל מצויין ללמוד ריפוי הפצע. זה יוצר על המשטח החיצוני של העין ומספק שכבת הגנה מכונות רישיות עינית. לפיכך, קרנית פונקציות כמו גדר ההפרדה גורמי מחלה, אובדן מים. הוא מורכב משלוש שכבות; האפיתל, משתית, אנדותל. האפיתל של הקרנית הופכת את השכבה החיצונית ביותר של הקרנית. תאים אפיתל לשמור על הפונקציה מכשול של הקרנית על ידי הקפדה זו לזו דרך צמתי צר1,2,3. Acellular הקרנית קרום המרתף, הקרום של באומן, מהנוזל האפיתל stroma מקיף, המכיל keratocytes עקשן. תחת stroma, תאי אנדותל ערוץ חומרים מזינים מים, חמצן על השכבה העליונה.
שריטות הקרנית נפוצים מאוד המרפאה4. פציעות בקרנית מגוונים, אך במידה רבה נגרמות על ידי חלקיקים קטנים כגון אבק או חול, שריטות או חפצים זרים אחרים. הפרוטוקול המתוארים כאן מטרות-להתרבות סוג הרלוונטית קלינית של שחיקה אפיתל הקרנית. בעשותו כן, פרוטוקול זה מספק שיטה לשליטה הזרע רופאים ומדענים הקרנית ליישם במחקרים משלהם. אנחנו שביצעת ויוו פציעה תיקון assay על הקרנית מאתר מאת ששרט את הרקמה עם צמח קוצני עינית dulled, השני Algerbrush. כאן, אנחנו למקד את השריטה רק על האפיתל הקרנית המרכזית ולהשאיר חלקים אחרים של איבר המין ללא נזק. כך, הפרוטוקול הוא אידיאלי כדי מחקר תאים אפיתל הקרנית דינמיקה או קרום המרתף במהלך epithelialization מחדש, התא ההעברה, התפשטות ובידול ויוו5. לאחרונה, מודל זה שימש כדי לנתח קדמון dynamics תא הקרנית מאתר כמו גם כדי לחשוף את היכולת של תאי אפיתל הקרנית הבדיל ביצירה מחדש את גומחת תאי גזע הקרנית לאחר פציעה6,7. בעקבות שחיקה, הקרנית חוזר חוזק ובשקיפות הרגיל שלה. מעניין, במחקר במבחנה ציינו שאת epithelialization מחדש תתרחש ללא התפשטות תאים מוגברת8. פרוטוקול זה מתאר את ציר הזמן של ריפוי ללא הפרעה הקרנית מאתר. השיטה ישימה ובכך לבחון את השפעת הסמים על ריפוי דפוסים ומהירות.
הקרנית כבר בשימוש נרחב עבור לימודי ריפוי הפצע. עם זאת, מחקרים רבים צריכים לסמוך על דגמים אחרים של פציעה. מודל ומבוססת של פגיעה הקרנית היא הכוויה אלקליין שהתבצעה על-ידי החלת הידרוקסיד הנתרן (NaOH) עם או בלי נייר סינון על פני הקרנית9. חשיפה אלקליין גורמת פגיעה גדולה, ' מאטום לשקוף ' משפיעה לא רק על אפיתל הקרנית, אלא גם את לחמית, משתית9,10. פתרונות אלקליין חזקה הוכחו לגרום כיבים הקרנית, opacification וכורוידאלית9. תאים דלקתיים לפלוש stroma בדרך כלל תוך 6 שעות ולהישאר שם עד 24 שעות11. לכן, פגיעה אלקליין היא שיטה מומלץ במחקרים הקשורים להפעלה סטרומה. סוג אחר של פגיעה כימיים יכולים להנחיל על-ידי החלת דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)9,הקרנית10. דגמים אחרים פציעה נפוצים כוללים incisional פצעים החודרים דרך הפצעים stroma, keratectomy, אשר מוגבלים לחלק העליון של ה-14,משתית15. שיטות אלה שימושיים גם לענות על שאלות לגבי ריפוי הפצע סטרומה. פציעה שונות הדגמים יש יתרונות וחסרונות משלהם. שחיקה, או הטריה, של האפיתל הקרנית פותחה לראשונה באמצעות ואזמלי מנתחים הושלו או להבים שמחוץ לקרנית16. שיטה זו כבר מאוחר יותר בשימוש ב- vivo על עכבר, חולדה ארנבת17,18,19,20,21,22. באמצעות של burr עינית (איור 1), אנחנו להסיר רק אזור שנבחר של האפיתל, משאיר את שאר האפיתל מעושה. בדרך זו, זה אפשרי למקד בדיוק להסרת האפיתל לחלקים שונים של הקרנית. בנוסף, גודל שחיקה יכול להידרש עם fluorescein מכתים. יתר על כן, כאן אנו עוקבים אחר הסגר שחיקה במהלך תקופת ההחלמה.
שיטה זו מהווה מספר יתרונות, i) כולל מיקומו המדוייק של שחיקה האתר, שאינה אפשרית עם פגיעה כימית, ii) שחיקה מהירה לביצוע, השלישי) זה לא פולשנית. במסמך זה, אנו מתארים את השיטה באמצעות העכבר NMRI outbred כמודל, אולם זה יכול להיות מיושם במגוון רחב של דגמים גנטיים העכבר, כמו גם עכבר, ארנב, אשר הם הדגמים הנפוצים המשמשות ללימוד הפרעה הקרנית האנושית.

<table><tbody><tr><td>NMRI mouse</td><td>Envigo</td><td>275</td><td></td></tr><tr><td>0.9% NaCl</td><td></td><td></td><td>use sterile</td></tr><tr><td>Medetomidine</td><td>Vetmedic</td><td>Vnr087896</td><td>Market name: Cepetor Vet</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Intervet</td><td>Vnr511485</td><td>Market name: Ketaminol Vet</td></tr><tr><td>Buprenorfin</td><td>Invidior</td><td>3015248</td><td>Market name: Temgesic</td></tr><tr><td>Atipamezol</td><td>Orion Pharma</td><td>Vnr471953</td><td>Market name: Antisedan Vet</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Norbrook</td><td>Vnr027579</td><td>Market name: Norocarp Vet</td></tr><tr><td>1% fucidin acid eye ointment</td><td>Dechra</td><td>Vnr080899</td><td>Market name: Isathal</td></tr><tr><td>Fluorescein salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline solution</td><td></td><td></td><td>PBS</td></tr><tr><td>Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)</td><td>Algerbrush</td><td>6.39768E+11</td><td></td></tr><tr><td>Cobalt Blue pen light</td><td>SP Services</td><td>DE/003</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>Kunz Instruments</td><td>2007-0217</td><td></td></tr><tr><td>Digital SLR camera</td><td>Nikon</td><td>D80</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable camera arm and clamp</td><td>Neewer</td><td>10086132</td><td>Height 28 cm</td></tr><tr><td>Table lamp with a flexible arm and a clamp</td><td>Prisma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soft wipe</td><td>KimtechScience</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>CO2 chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection toolset</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringes</td><td>Beckton Dickinson</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>26G needles</td><td>Beckton Dickinson</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Eppendorf tube</td><td>Sarstedt</td><td>689</td><td></td></tr><tr><td>Tissue casette</td><td>Sakura Finetech</td><td>4118F</td><td></td></tr><tr><td>Tissue processing machine ASP200S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR</td><td>UN1307</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin wax</td><td>Millipore</td><td>K95523361</td><td></td></tr><tr><td>Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm</td><td>Sakura Finetech</td><td>4123</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Microm</td><td>HM355</td><td></td></tr><tr><td>Water bath for sectioning</td><td>Orthex</td><td>60591</td><td></td></tr><tr><td>Water bath for sectioning</td><td>Leica</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Microtome blade</td><td>Feather</td><td>S35</td><td></td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Th.Geyer GmbH &amp;amp; Co.</td><td>7,695,019</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td>Millipore</td><td>MPGP04001</td><td>MilliQ</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>PFA</td></tr></tbody></table>

corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing

הקרנית מאתר מספק מודל מצויין ללמוד ריפוי הפצע. הקרנית היא השכבה החיצונית ביותר של העין, וכך היא ההגנה הראשונה לפגיעה. למעשה, הוא הסוג הנפוץ ביותר של פגיעת עין שנמצאו קליניקה שחיקה הקרנית. כאן, אנו מנצלים של burr בעדשת העין לזירוז של שחיקה וכתוצאה מכך הסרת אפיתל הקרנית ויוו על עכברים מורדם. שיטה זו מאפשרת להפרעה יישוב, לשחזור אפיתל, עוזב בתחומים אחרים ללא פגע. בנוסף, אנו מתארים את הפריט החזותי של האפיתל משופשפים עם fluorescein מכתים, לספק ייעוץ קונקרטי על דרך להמחיש את הקרנית משופשפים. לאחר מכן, אנו עוקבים אחר ציר הזמן של ריפוי 0, 18 ו- 72 h לאחר שחיקה, עד שהפצע הוא epithelialized מחדש הפצע. המודל שחיקה אפיתל הקרנית הפגיעה הינו אידיאלי עבור מחקרים על התפשטות תאים אפיתל, הגירה, epithelialization מחדש של השכבות הקרנית. עם זאת, שיטה זו אינה אופטימלית ללמוד הפעלה סטרומה במהלך ריפוי הפצע, כי burr עינית שאינה לחדור אל הרבדים תאי סטרומה. שיטה זו מתאימה גם ליישומים קליניים, לדוגמה, ניסויים פרה-קליניים מבחן של יעילות התרופה.

פרוטוקול זה מתאר מודל לגרום פגיעה שחיקה הקרנית העכבר ומציעה כיצד פעל והמחש את תהליך הריפוי לאחר שחיקה. לאחרונה, אנחנו מועסקים בשיטה זו כדי ללמוד את התפקיד של ובתאים אפיתל הקרנית במהלך6ריפוי הפצע. שימוש בכלים הוקמה היא המפתח ניסוי מוצלח שחיקה. אנחנו, ואחרים, ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing at JoVE.com

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

אפיתל שחיקה הקרנית עם עינית Burr כמודל עבור קרנית ריפוי פצעים

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי לגרום של שחיקה השטח עינית של העכבר, בצע את לאחר מכן תהליך ריפוי הפצע. הפרוטוקול מנצל burr עינית חלקית להסרת האפיתל פני השטח של העין בעכברים מרדימים.

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

corneal-epithelial-abrasion-with-ocular-burr-as-model-for-cornea

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

20.3K Views.  University of Helsinki. פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי לגרום של שחיקה השטח עינית של העכבר, בצע את לאחר מכן תהליך ריפוי הפצע. הפרוטוקול מנצל burr עינית חלקית להסרת האפיתל פני השטח של העין בעכברים מרדימים.

Video: Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells&#8217; native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens1. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

הקמת קלינית רלוונטי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; דגם ניתוח קטרקט מוק לחקירת תיקון פצע אפיתל במייקרו-סביבה של ילידים

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Developmental Biology

Investigating Scarless Tissue Regeneration in Embryonic Wounded Chick Corneas

Chick embryonic corneal wounds display a remarkable capacity to fully and rapidly regenerate, whereas adult wounded corneas experience a loss of transparency due to fibrotic scarring. The tissue integrity of injured embryonic corneas is intrinsically restored with no detectable scar formation. Given its accessibility and ease of manipulation, the chick embryo is an ideal model for studying scarless corneal wound repair. This protocol demonstrates the different steps involved in wounding the cornea of an embryonic chick in ovo. First, eggs are windowed at early embryonic ages to access the eye. Second, a series of in ovo physical manipulations to the extraembryonic membranes are conducted to ensure access to the eye is maintained through later stages of development, corresponding to when the three cellular layers of the cornea are formed. Third, linear cornea wounds that penetrate the outer epithelial layer and the anterior stroma are made using a microsurgical knife. The regeneration process or fully restored corneas can be analyzed for regenerative potential using various cellular and molecular techniques following the wounding procedure. Studies to date using this model have revealed that wounded embryonic corneas display activation of keratocyte differentiation, undergo coordinated remodeling of ECM proteins to their native three-dimensional macrostructure, and become adequately re-innervated by corneal sensory nerves. In the future, the potential impact of endogenous or exogenous factors on the regenerative process could be analyzed in healing corneas by using developmental biology techniques, such as tissue grafting, electroporation, retroviral infection, or bead implantation. The current strategy identifies the embryonic chick as a crucial experimental paradigm for elucidating the molecular and cellular factors coordinating scarless corneal wound healing.

The present protocol demonstrates the different steps involved in wounding the cornea of an embryonic chick in ovo. The regenerating or fully restored corneas can be analyzed for regenerative potential using various cellular and molecular techniques following the wounding procedure.&#160;

חקר התחדשות רקמות ללא צלקות בקרנית אפרוח פצועה עוברית

Chick embryonic corneal wounds display a remarkable capacity to fully and rapidly regenerate, whereas adult wounded corneas experience a loss of ...

A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with conjunctiva. Patients suffer from recurrent corneal defects, pain, inflammation, and loss of vision.
Previously, a murine model of LSCD was described and compared to two other models. The goal was to produce a consistent mouse model of LSCD that both mimics the phenotype in humans and lasts long enough to make it possible to study the disease pathophysiology and to evaluate new treatments. Here, the technique is described in more detail.
A motorized tool with a rotating burr has been designed to remove the rust rings from the corneal surface or to smooth the pterygium bed in patients. It is a suitable device to create the desired LSCD model. It is a readily available, easy-to-use tool with a fine tip that makes it appropriate for working on small eyes, as in mice. Its application prevents unnecessary trauma to the eye and it does not result in unwanted injuries, as often is the case with chemical injury models. As opposed to a blunt scraper, it removes the epithelium with the basement membrane. In this protocol, the limbal area was abraded two times, and then the whole corneal epithelium was shaved from limbus to limbus. To avoid stroma injury, care was taken not to brush the corneal surface once the epithelium was already removed.

The following article provides an easy, reproducible technique to effectively create a sustainable mouse model of limbal stem cell deficiency (LSCD). This animal model is useful in testing and comparing the efficacy of treatments for limbal stem cell diseases.

נוהל מכני פשוט ליצור מחסור בתאי גזע limbal עכבר

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two dimensional (2D) and three dimensional (3D) culture has generated a wealth of information not only about corneal biology but also about wound healing, myofibroblast biology, and scarring in general. The goal of the protocol is an assay system for quantifying myofibroblast development, which characterizes scarring. We demonstrate a corneal organ culture ex vivo model using pig eyes. In this anterior keratectomy wound, corneas still in the globe are wounded with a circular blade called a trephine. A plug of approximately 1/3 of the anterior cornea is removed including the epithelium, the basement membrane, and the anterior part of the stroma. After wounding, corneas are cut from the globe, mounted on a collagen/agar base, and cultured for two weeks in supplemented-serum free medium with stabilized vitamin C to augment cell proliferation and extracellular matrix secretion by resident fibroblasts. Activation of myofibroblasts in the anterior stroma is evident in the healed cornea. This model can be used to assay wound closure, the development of myofibroblasts and fibrotic markers, and for toxicology studies. In addition, the effects of small molecule inhibitors as well as lipid-mediated siRNA transfection for gene knockdown can be tested in this system.

A protocol for an ex vivo corneal organ culture model useful for wound healing studies is described. This model system can be used to assess the effects of agents to promote regenerative healing or drug toxicity in an organized 3D multicellular environment.

Ex-Vivo איברים הקרנית מודל תרבות עבור ריפוי פצעים מחקרים

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its transparency. However, due to its external position, the cornea is highly susceptible to a wide variety of injuries that can lead to the loss of corneal transparency and eventual blindness. Efficient corneal wound healing in response to these injuries is pivotal for maintaining corneal homeostasis and preservation of corneal transparency and refractive capabilities. In events of compromised corneal wound healing, the cornea becomes vulnerable to infections, ulcerations, and scarring. Given the fundamental importance of corneal wound healing to the preservation of corneal transparency and vision, a better understanding of the normal corneal wound healing process is a prerequisite to understanding impaired corneal wound healing associated with infection and disease. Toward this goal, murine models of corneal wounding have proven useful in furthering our understanding of the corneal wound healing mechanisms operating under normal physiological conditions. Here, a protocol for creating a central corneal epithelial abrasion in mouse using a trephine and a blunt golf club spud is described. In this model, a 2 mm diameter circular trephine, centered over the cornea, is used to demarcate the wound area. The golf club spud is used with care to debride the epithelium and create a circular wound without damaging the corneal epithelial basement membrane. The resulting inflammatory response proceeds as a well-characterized cascade of cellular and molecular events that are critical for efficient wound healing. This simple corneal wound healing model is highly reproducible and well-published and is now being used to evaluate compromised corneal wound healing in the context of disease.

Here, a protocol for creating a central corneal epithelial abrasion wound in the mouse using a trephine and a blunt golf club spud is described. This corneal wound healing model is highly reproducible and is now being used to evaluate compromised corneal wound healing in the context of diseases.

מודל שחיקה אפיתליאלית לחקר ריפוי פצעי הקרנית

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

Ex Vivo and In Vivo Animal Models for Mechanical and Chemical Injuries of Corneal Epithelium

Corneal injury to the ocular surface, including chemical burn and trauma, may cause severe scarring, symblepharon, corneal limbal stem cells deficiency, and result in a large, persistent corneal epithelial defect. Epithelial defect with the following corneal opacity and peripheral neovascularization result in irreversible visual impairment and hinder future management, especially keratoplasty. Since the animal model can be used as an effective drug development platform, models of corneal injury to the mouse and alkali burn to rabbit corneal epithelium are developed here. New Zealand white rabbit is used in the alkali burn model. Different concentrations of sodium hydroxide can be applied onto the central circular area of the cornea for 30 s under intramuscular and topical anesthesia. After copious isotonic normal saline irrigation, residual loose corneal epithelium was removed with corneal burr deep down to the Bowman's layer within this circular area. Wound healing was documented by fluorescein staining under Cobalt blue light. C57BL/6 mice were used in the traumatic model of murine corneal epithelium. The murine central cornea was marked using a skin punch, 2 mm in diameter, and then debrided by a corneal rust ring remover with a 0.5 mm burr under a stereomicroscope. These models can be prospectively used to validate the therapeutic effect of eye drops or mixed agents such as stem cells, which potentially facilitate corneal epithelial regeneration. By observing corneal opacity, peripheral neovascularization, and conjunctival congestion with stereomicroscope and imaging software, therapeutic effects in these animal models can be monitored.

Ex Vivo and In Vivo Animal Models for Mechanical and Chemical Injuries of Corneal Epithelium

Here, animal models based on mouse and rabbit are developed for mechanical and chemical injury of corneal epithelium to screen new therapeutics and the underlying mechanism.

מודלים של בעלי חיים של Ex Vivo ו-In Vivo לפציעות מכניות וכימיות של אפיתל הקרנית

Corneal injury to the ocular surface, including chemical burn and trauma, may cause severe scarring, symblepharon, corneal limbal stem cells deficiency, ...

פרוטוקולי נזק לסיבי חישה בקרנית למחקרי רגנרציה של אקסונים

Three Strategies to Induce Neurotrophic Keratitis and Nerve Regeneration in Murine Cornea

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation provides sensation and trophic function to the eye and contributes to preserving corneal integrity. The pathological disruption of this innervation is termed neurotrophic keratitis. This can be triggered by injury to the eye, surgery, or disease. In this study, we propose three different protocols for inflicting damage on the innervation in ways that recapitulate the three types of cases generally encountered in the clinic.
The first method consists in making an abrasion of the epithelium with an ophthalmic burr. This involves the removal of the epithelial layer, the free nerve endings, and the subbasal plexus in a manner similar to the photorefractive keratectomy surgery performed in the clinic. The second method&#160;only targets the innervation by sectioning it at the periphery with a biopsy punch, maintaining the integrity of the epithelium. This method is similar to the first steps of lamellar keratoplasty and leads to a degeneration of the innervation followed by regrowth of the axons in the central cornea. The last method damages the innervation of a transgenic mouse model using a multiphoton microscope, which specifically localizes the site of cauterization of the fluorescent nerve fibers. This method inflicts the same damage as photokeratitis, an overexposure to UV light.
This study describes different options for investigating the physiopathology of corneal innervation, particularly the degeneration and regeneration of the axons. Promoting regeneration is crucial for avoiding such complications as epithelium defects or even perforation of the cornea. The proposed models can help test new pharmacological molecules or gene therapy that enhance nerve regeneration and limit disease progression.

מחבר זרקור: קידום מחקר אינרבציה של הקרנית באמצעות מודלים חדשניים 

Here, we propose three different methods of damaging the sensory fibres innervating the cornea. These methods facilitate the study of axon regeneration in mice. These three methods, which are adaptable to other animal models, are ideal for the study of corneal innervation physiology and regeneration.

שלוש אסטרטגיות לגרימת קראטיטיס נוירוטרופית והתחדשות עצבית בקרנית מורין

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation ...

Neuroscience

Mongolian Gerbils as an Animal Model of Wound Healing

Corneal wound healing studies have been conducted for a long time and have helped to reduce suffering and develop treatments that contribute to improving patients' eye health. Historically, corneal healing has been studied in rodents such as mice and rats, but these models might not completely mimic human disorders. However, information on other rodents such as Mongolian gerbils (Meriones unguiculatus) is scant in corneal research.
Here, we describe a technique to develop a novel animal model for studying corneal healing after photorefractive keratectomy. Due to the limited literature available on the cornea of M. unguiculatus, we also describe a histological analysis of the normal cornea. These research techniques can also be employed in the study of eye diseases because of the similarity between the corneas of Mongolian gerbils and humans in terms of genetics, anatomy, and physiology.

This article describes a new animal model developed to study the anatomy and histology of the cornea and its healing processes. This new animal model uses the Mongolian gerbil, which has a cornea with many similarities to the human cornea.

גרבילים מונגולים כמודל חייתי לריפוי פצעים

Corneal wound healing studies have been conducted for a long time and have helped to reduce suffering and develop treatments that contribute to improving ...

אפיתל שחיקה הקרנית עם עינית Burr כמודל עבור קרנית ריפוי פצעים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הקמת קלינית רלוונטי

חקר התחדשות רקמות ללא צלקות בקרנית אפרוח פצועה עוברית

נוהל מכני פשוט ליצור מחסור בתאי גזע limbal עכבר

Ex-Vivo איברים הקרנית מודל תרבות עבור ריפוי פצעים מחקרים

מודל שחיקה אפיתליאלית לחקר ריפוי פצעי הקרנית

מודלים של בעלי חיים של Ex Vivo ו-In Vivo לפציעות מכניות וכימיות של אפיתל הקרנית

שלוש אסטרטגיות לגרימת קראטיטיס נוירוטרופית והתחדשות עצבית בקרנית מורין

שלוש אסטרטגיות לגרימת קראטיטיס נוירוטרופית והתחדשות עצבית בקרנית מורין

שלוש אסטרטגיות לגרימת קראטיטיס נוירוטרופית והתחדשות עצבית בקרנית מורין

גרבילים מונגולים כמודל חייתי לריפוי פצעים