Name: subcellular fractionation from fresh and frozen gastrointestinal specimens
Uploaded: 2018-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens at JoVE.com

מחברים להכיר את הסיוע של לופז Ander ו Miren Telletxea הקלטה ועריכה וידאו. ACR ממומן על-ידי התחברות Ikerbasque של פרויקט מחקר שבסיסה Celiacos דה מדריד (ACM). מחדרהמלון הוא ממומן על ידי פרויקט ISCIII-PI16/00258, והיתה שותפה במימון מאת האיחוד האירופי ERDF/ESF "דרך להפוך את אירופה". הוא ממומן על ידי מענק פרוייקט מחקר 2015111068 של מחלקת הבריאות בסקית. IRG מלכה פרחיה נתמכים על ידי מענקים מלגת predoctoral את UPV/EHU והבסקים משרד החינוך, בהתאמה.

מחקר זה אושרה על-ידי קרוסס אוניברסיטת אתיקה המנהלים, ניתוחים בוצעו לאחר הסכמה מדעת היה המתקבלים בכל המקצועות או הוריהם.
1. ביופסיה אוסף
הערה: דגימות ביופסיה מן התריסריון דיסטלי של המטופלים מתקבלים במהלך אנדוסקופיה אבחון שגרתי ניהול ביופסיות הטווח בין 2 ו- 10 מ"ג במשקל. הרקמה ביופסיה היא רקמה מורכבת המורכב לסוגי תאים שונים לרבות אפיתל, מערכת החיסון ותאי אנדותל. הגסטרואנטרולוגיה קליניים לבצע אנדוסקופיה את הבאים הוקמה הנחיות קליניות.
<ol><li>הנח את הביופסיה על נייר סינון סטרילי רק לאחר אנדוסקופיה.</li>
	<li>להשתמש מלקחיים כדי להעביר את ביופסיות 1.5 mL צינורות, להשרות אותם עם PBS, ולמקם אותו לתוך cryotube.</li>
	<li>שמור צינורות על הקרח עד שהם מגיעים במעבדה.<ol>
<li>הפעל עיבוד של ביופסיות טריים באופן מיידי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ביופסיות קפוא, פלאש להקפיא את הביופסיה המכילים צינורות, לאחסן בחנקן נוזלי עד השימוש. הערה: חשוב לשמור על המדגם קפוא עד המאגר שהושלם קר 1 נוסף.</li>
</ol>2. מאגר הכנה
הערה: לפני שמתחילים, תוספת המאגרים כדלקמן.
<ol><li>להוסיף 1 מ"מ DTT (ריכוז סופי), מאגר פרוטאז, פוספטאז מעכב קוקטייל (1 x ריכוז סופי) למאגר היפוטוניק 1, hypertonic 2 (טבלה 1).<ol>
<li>להכין 1.5 מ של מאגר 1 ו- 150 µL מאגר 2 עבור דגימה. DTT יהיה למנוע החמצון של הדגימות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין מאגר שטיפת גרעינים על-ידי הוספת 1% דטרגנט (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) כדי ריכוז סופי של 0.1% אל המאגר כבר שהושלם 1. להכין 1 מ"ל גרעינים מאגר שטיפת לדגימה.</li>
</ol>3. ביופסיה המגון
<ol><li>
ביופסיות טריים
	<ol>
<li>מקום איחדו חד פעמיים את המיקסר ממונע. לוודא איחדו יגיע לתחתית הצינור.</li>
		<li>להוציא את הביופסיה מ cryotube ולמקם אותו צינור 1.5 מ עם טיפ פיפטה.</li>
		<li>להוסיף 200 µL מאגר שהושלם 1 צינור 1.5 מ.</li>
		<li>Homogenize את הביופסיה עם איחדו עד הרקמה מופרת לחלוטין ולשמור אותו בקרח.</li>
		<li>לאחר כל והביופסיות הם הומוגני להמשיך בשלב 4. הערה: יש לשנות בקווקז חד פעמי בין ביופסיות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ביופסיות קפוא התראה: להתמודד עם חנקן נוזלי בקפידה; מגע של חנקן נוזלי עם העור או העיניים עלול לגרום פגיעה חמורה מקפיא. להגן על כפות הידיים והעיניים תמיד בעת עבודה עם חנקן נוזלי.<ol>
<li>קח כמה חנקן נוזלי בתוך קופסה לאחסון את cryotubes שאוחזר למיכל חנקן.</li>
		<li>למצוא את הביופסיה במיכל חנקן ולמקם את cryotube בתיבה עם החנקן הנוזלי. חזור על שלב זה עבור כל והביופסיות.</li>
		<li>להעביר את הביופסיה cryotube צינור 1.5 מ. הערה: ביופסיות תצורף הצינור קפוא. לדחוף את הביופסיה עם טיפ פיפטה סטרילי אז זה הם ינותקו מהצינור.</li>
		<li>להוסיף 200 µL מאגר שהושלם 1.</li>
		<li>Homogenize הרקמה באמצעות שהעקב ופצצות מרגמה עד הרקמה מופרת לחלוטין, שמירה על הטמפרטורה ב 4 מעלות צלזיוס לאורך כל ההליך. הערה: אל תתנו ביופסיות להפשיר לפני הוספת המאגר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ציטופלזמה בידוד
<ol><li>דגירה ביופסיה homogenized על קרח למשך 10 דקות.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של 1% סבון (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) כל דגימה כדי ריכוז סופי של 0.05%. הערה: תאים ויוצרים פרץ על ידי פירוק osmotic כמו הנוזל מתון ישבש את קרום התא.</li>
	<li>דגירה על קרח למשך 5 דקות.</li>
	<li>מערבולת בקצרה, צנטריפוגה ב 400 x g ב- 4 הלעפה תרוטרפמט למשך 2 דקות.</li>
	<li>לאחר vortexing, להסיר את תגובת שיקוע, להעביר אותו צינור נקי mL 1.5; זה יהיה השבר cytoplasmic. אל תמחק את גלולה.</li>
</ol>5. גרעיני בידוד
<ol><li>Resuspend בגדר מהשלב הקודם עם 200 µL גרעינים שטיפת המאגר.</li>
	<li>Centrifuge את הצינור למשך 2 דקות 400 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>למחוק את תגובת שיקוע, חזור על התהליך הכביסה פעמיים נוספות. הערה: מנקי יסיר cytoplasmic זיהום בהשבר הגרעין.</li>
	<li>לאחר לשטוף את השלישי, resuspend בגדר ב 100 µL מאגר 2.</li>
	<li>לנער את הדגימה נמרצות ב 4 הלעפה תרוטרפמט במשך 30 דקות לחלופין, דגירה המדגם על קרח, מערבולת כל 5 דקות.</li>
	<li>לאחר טלטולים, centrifuge את הדגימה 10 דקות בשיא המהירות (> 12,000 x g) ו- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאחר vortexing, להעביר את תגובת שיקוע לתוך 1.5 נקי חדש. mL שפופרת. זה יהיה השבר הגרעין.</li>
</ol>6. חלבון כמת
הערה: לכמת את החלבונים עם bicinchoninic חומצה (BCA) חלבון assay ערכת. ריכוז חלבונים בהשברים ינוע בין 0.5 ל- 5 µg/µL, להיות נמוך השבר הגרעין (ראו טבלה 2 ריכוז חלבון הנובעת מ- 2 מ ג ביופסיות).
<ol><li>להכין עיקול רגיל עם כמויות (µg) אלבומין שור (BSA) שלהלן12: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.</li>
	<li>הכינו את ריאגנטים הדרושים לשימוש µL 100 של המיקס הסופי BCA לדגימה.</li>
	<li>פיפטה 2 µL של כל שבר חלבון במנת טוב 96, להוסיף את תערובת BCA, בצע את הוראות היצרן עבור הקריאה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics.">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).</li><li>Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+quantitative+and+dynamic+mapping+of+protein+subcellular+localization.">Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , (1998).</li><li>Alex, P., Gucek, M., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+proteomics+in+the+study+of+inflammatory+bowel+diseases:+Current+status+and+future+directions+with+available+technologies.">Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies.</a> Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).</li><li>Ericsson, C., Franz&#233;n, B., Nist&#233;r, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+tissue+biobanks.+Tissue+handling,+cryopreservation,+extraction,+and+use+for+proteomic+analysis.">Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis.</a> Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).</li><li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+application+of+a+subcellular+fractionation+method+to+kidney+and+testis+for+the+determination+of+conjugated+linoleic+acid+in+selected+cell+organelles+of+healthy+and+cancerous+human+tissues.">New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).</li><li>Foster, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mammalian+Organelle+Map+by+Protein+Correlation+Profiling.">A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling.</a> Cell. 125 (1), 187-199 (2006).</li><li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li><li>B&#246;rner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+protein+extraction+from+human+pancreatic+cancer+tissues.">Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).</li><li>Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+disease:+protease+functions+in+intestinal+mucosal+pathobiology.">Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology.</a> Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).</li><li>Cutler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein purification protocols. , (2004).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bicinchoninic+Acid+(BCA)+Assay+for+Protein+Quantitation.">The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).</li><li>McLane, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localization+of+T-bet+and+Eomes+in+CD8+T+cell+memory+populations.">Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).</li><li>Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRM1+nuclear+export+protein+in+normal+development+and+disease.">The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease.</a> International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

הפרוטוקול המתואר כאן משמש את fractionation גרעינית, cytoplasmic של ביופסיות מעיים. החלבונים מטוהרת הם לא שפגע בסימני והוא יכול לשמש לא רק בניתוח תספיג כמוצג באיור 2 ו- 3 אלא גם מבחני הדורשים מקופלת מקורי חלבונים כגון immunoprecipitation, electrophoretic ניידות shift assay (EMSA) או יליד לזיהוי בג'ל (עמו...

חלבונים להשתתף כמעט את כל הפונקציות הביולוגי בתוך תא, כל וריאציה במבנה שלהם, כמות או מיקום יכול להוביל תרחיש פתוגניים. רקמות מדגם fractionation שיטות הן בגישה שימושי כדי להפחית את המורכבות של מחלות הקשורות חלבון ניתוחים. מספר מחקרים להשתמש במידע לוקליזציה חלבון או להעשיר את חלבון מתא סלולרית ספציפית, אז עבור fractionation לשחזור של חלבונים שלמים פרוטוקול זה שימושי לענות על שאלות ביולוגיות מסוימות. לקביעת ההתאמה subcellular של חלבונים וניטור הפצה compartmental או אינטראקציות על הבסיס שלהם תנאים המחלה תסייע לזהות מחלה הקשורה הבדלים תפקודיים1,2. לכן, בשיטה זו שואפת reproducibly fractionate רקמת המעי ביופסיות, טריים וקפואים, לתוך תאים subcellular cytoplasmic וגרעיני.
דגימות הביופסיה מעיים מתקבלים באופן שגרתי במהלך אנדוסקופיה הליכים3 (איור 1), יכול לשמש ביעילות עבור כימות חלבון או לימודים immunoprecipitation. מאז דגימות רקמה מן המעי אפיתל יכיל חלבונים אשר עשויים להיות מעורבים ישירות בפתוגנזה המחלה4, דגימות ביופסיה מעיים הם מקור חשוב מאוד לצורך זיהוי מוצלח מעיים מחלות ספציפיות חלבונים. דגימות רקמה, החולה קפוא מאוחסנים יחד עם המידע הקליני הם משאבים שימושיים עבור חלבונים, הכנה מדגם לשחזור ופשוט הוא סוגיה מרכזית לספק מידע compartmental תא באמצעות הגבלת כמויות קפוא רקמות5.
ישנם מספר ערכות זמינים מסחרית לצורך הקמת מכשול ההפרדה של שברים הסלולר, אבל אלה יקרים יותר, בדרך כלל זמן רב יותר מאשר בפרוטוקול המוצג כאן. פרוטוקולים בהתבסס על צנטריפוגה הדרגתיים מרובים-צעד, מעברי צבע רציף גם בעבר שימשו את fractionation של מגוון התאית בתאים ברקמות שונות6,7. עם זאת, שמירה על מרקם של מעברי צבע רציף לעתים קרובות משימה קשה. פרוטוקולים דומה המבוסס על פירוק רציפים של ממברנות תוארו קודם לכן אבל הם בדרך כלל צריך יותר משני מאגרי, הידיים בזמן הוא עוד8 .
כאשר fractionating דגימות רקמה, לזכור את הרקמה הזאת דגימות נוכח תא התא, התא-מטריקס אינטראקציות כי הן לא נוכח בתאים בתרבית חשוב בעת הליך שאיבת חלבון. פירוט נאותה בין תאים מטריצה חוץ-תאית מבלי להשפיע על איכות החלבון יהיה גורם קריטי ב בידוד חלבון9רקמת המעי. ב פרוטוקול זה, אנשי קשר תא התא, התא-מטריקס הם קודם שבור, משחררים את התאים ומאפשר את המאגר להגיע אל התאים הבודדים. כדי למנוע ערבוב לפני fractionation חלבון-תא, פירוט של אנשי הקשר להתרחש מבלי לשנות את התקינות של התאים או את הקרומים גרעיני.
בשל העשרת של פרוטאזות שונים רירית המעי10, חשוב לשלוט השפלה חלבון במהלך החילוץ. כדי למזער את ההשפלה חלבון פוטנציאליים, מעכבי פרוטאז מרובים חייבים להיכלל במאגרי מיצוי חלבונים. בנוסף, אם תמציות עומדים לשמש עבור מבחני פונקציונלי, זה חיוני כדי למנוע את דנטורציה של חלבונים או proteolysis כמו זה יגרום לאובדן חלבון פעילות11. למטרה זו, הפרוטוקול מבוצע ב 4 ° C, phenylmethylsulfonyl טריים פלואוריד (PMSF) מתווסף המאגרים-ריכוז סופי של 0.1 מ מ רק לפני השימוש כדי לעכב עוד יותר proteolysis.
הצעד הראשון תא fractionation הוא שיבוש רקמות פירוק התא. כאמור, המטרה היא disaggregate את התאים ואת לשבור שאותם לפתוח במינימום נזקים. דגימות רקמה מעיים חייבת להיות הומוגני, התאים lysed כדי להשיג שבירה המרבי של קרום התא. ב פרוטוקול זה, אנו משתמשים במערבל שהעקב ממונע לשבור רקמת המעי אשר הוא הומוגני תוך שניות על-ידי פעולה vortexing במהירות גבוהה. לאחר המגון, תאי הרקמות מודגרת בתוך מאגר היפוטוניק יפרץ קרום התא, אך ימנע הגרעינים שלמים, ואחריו תוספת של חומר ניקוי denaturing (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) מערבולת קצר להפרדת הגרעינים מתוך השבר cytoplasmic. לאחר הסרת הציטופלסמה, קרום גרעין התא הוא פרץ לתוך מאגר hypertonic ברעידות.
השיטה המוצגת כאן היא שיטה המתאימה עבור fractionation subcellular של ביופסיות מעיים טריים וקפואים זה הושגו במהלך הליכי אנדוסקופי, נע בין 2 ו- 10 מ"ג במשקל. את הפרוטוקול היא קלה, לשחזור ואת יכולה להתבצע באמצעות מכשור מעבדתי בסיסי, ריאגנטים בתוך פחות משעה.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-1kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5588886-1kg</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase and phosphatase inhibitors</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>NP-40&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CA-630</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>BCA assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td>Protein quantification kit</td></tr><tr><td>Disposable plastic pestles</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Dounce homogeneizer</td><td>VWR</td><td>431-0100</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415-R</td><td></td></tr><tr><td>Shacker</td><td>IKA</td><td>MS3 basic</td><td></td></tr></tbody></table>

subcellular fractionation from fresh and frozen gastrointestinal specimens

המטרה של פרוטוקול זה היא fractionate רקמה אנושית מעיים מתקבל על ידי אנדוסקופיה לתוך תאים גרעינית, cytoplasmic לניתוח לוקליזציה של חלבונים ספציפיים או חלבון מתחמי במדינות רקמות שונות (קרי, בריא נגד המחלה). שיטה זו שימושית עבור fractionation של שתי דגימות רקמה מעיים טריים וקפואים; זה נגיש עבור כל המעבדות לא זמן רב.

איור 1 מראה של צביעת אאוזין hematoxylin של מקטע המעי ביופסיה עם שלם villi ומבנים הקריפטה.
התוצאות נציג של fractionation גרעינית, cytoplasmic באמצעות פרוטוקול זה מוצגים נתוני 2 ו- 3. בניסוי שמוצג באיור 2, רעננה (F...

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens at JoVE.com

Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע של fractionation סלולרית פשוטה לצורך הקמת מכשול ההפרדה subcellular של חלבונים cytoplasmic וגרעיני ב אנושי ביופסיות מעיים טריים וקפואים.

Fractionation subcellular של דגימות מדרכי העיכול טריים וקפואים

The purpose of this protocol is to fractionate human intestinal tissue obtained by endoscopy into nuclear and cytoplasmic compartments for the ...

subcellular-fractionation-from-fresh-frozen-gastrointestinal

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Immunology and Infection

Unit 1

An Overview of the Gastrointestinal System: Anatomy, Physiology, and Assessment

SCIENTISTS IN ACTION

9.7K Views.  University of the Basque Country (UPV-EHU), Biocruces Health Research Institute. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע של fractionation סלולרית פשוטה לצורך הקמת מכשול ההפרדה subcellular של חלבונים cytoplasmic וגרעיני ב אנושי ביופסיות מעיים טריים וקפואים.

Video: Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and promotion of the tumor microenvironment. While there are currently many techniques for the isolation of MFs from gastrointestinal (GI) tissues, this protocol introduces a novel element of isolation of these stromal cells from frozen tissue. Freezing GI tissue specimens not only allows the researcher to acquire samples from worldwide collaborators, biobanks, and commercial vendors, it also permits the delayed processing of fresh samples. The described protocol will consistently yield characteristic spindle-shaped cells with the MF phenotype that express the markers CD90, &#945;-SMA and vimentin. As these cells are derived from patient samples, the use of primary cells also confers the benefit of closely mimicking MFs from disease states-namely cancer and inflammatory bowel diseases. This technique has been validated in gastric, small bowel, and colonic MF primary culture generation. Primary MF cultures can be used in a vast array of experiments over a number of passage and their purity assessed by both immunocytochemistry and flow cytometry analysis.

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

בידוד של פיברובלסטים / myofibroblasts 90 + CD מאדם דוגמאות במערכת העיכול קפוא


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

Developmental Biology

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. This method utilizes hypotonic buffers, digitonin, mechanical lysis and differential centrifugation to isolate the cytoplasm, mitochondria and plasma membrane. The process can be scaled to accommodate the needs of researchers, is inexpensive and straightforward. This method will allow researchers to determine protein localization in cells without specialized centrifuges and without the use of commercial kits, both of which can be prohibitively expensive. We have successfully used this method to separate cytosolic, plasma membrane and mitochondrial proteins in the human monocyte cell line U937.

Here, we present a protocol to isolate the plasma membrane, cytoplasm and mitochondria of U937 cells without the use of high-speed centrifugation. This technique can be used to purify subcellular fractions for subsequent examination of protein localization via immunoblotting.

תא Fractionation של תאים U937, בהעדר צנטריפוגה במהירות גבוהה

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Biochemistry

Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq

Adult diffuse gliomas exhibit inter- and intra-tumor heterogeneity. Until recently, the majority of large-scale molecular profiling efforts have focused on bulk approaches that led to the molecular classification of brain tumors. Over the last five years, single cell sequencing approaches have highlighted several important features of gliomas. The majority of these studies have utilized fresh brain tumor specimens to isolate single cells using flow cytometry or antibody-based separation methods. Moving forward, the use of fresh-frozen tissue samples from biobanks will provide greater flexibility to single cell applications. Furthermore, as the single-cell field advances, the next challenge will be to generate multi-omics data from either a single cell or the same sample preparation to better unravel tumor complexity. Therefore, simple and flexible protocols that allow data generation for various methods such as single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) and single nucleus Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (snATAC-seq) will be important for the field.
Recent advances in the single cell field coupled with accessible microfluidic instruments such as the 10x genomics platform have facilitated single cell applications in research laboratories. To study brain tumor heterogeneity, we developed an enhanced protocol for the isolation of single nuclei from fresh frozen gliomas. This protocol merges existing single cell protocols and combines a homogenization step followed by filtration and buffer mediated gradient centrifugation. The resulting samples are pure single nuclei suspensions that can be used to generate single nucleus gene expression and chromatin accessibility data from the same nuclei preparation.

Intra-tumoral heterogeneity is an inherent feature of tumors, including gliomas. We developed a simple and efficient protocol that utilizes a combination of buffers and gradient centrifugation to isolate single nuclei from fresh frozen glioma tissues for single nucleus RNA and ATAC sequencing studies.

בידוד גרעינים מגידולים טריים במוח קפוא ל-RNA-seq חד-גרעיני ו-ATAC-seq

Adult diffuse gliomas exhibit inter- and intra-tumor heterogeneity. Until recently, the majority of large-scale molecular profiling efforts have focused ...

Cancer Research

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and isopycnic density gradient centrifugation. The major advantage of this procedure is that it does not rely on the sole use of solubilizing detergents to obtain subcellular fractions. This makes it possible to separate the plasma membrane from other membrane-bound organelles of the cell. This procedure will facilitate the determination of protein localization in cells with a reproducible, scalable, and selective method. This method has been successfully used to isolate cytosolic, nuclear, mitochondrial, and plasma membrane proteins from the human monocyte cell line, U937. Although optimized for this cell line, this procedure may serve as a suitable starting point for the subcellular fractionation of other cell lines. Potential pitfalls of the procedure and how to avoid them are discussed as are alterations that may need to be considered for other cell lines.

This fractionation protocol will allow researchers to isolate cytoplasmic, nuclear, mitochondrial, and membrane proteins from mammalian cells. The latter two subcellular fractions are further purified via isopycnic density gradient.

פיצול תאים של תאי U937 על ידי טיהור הדרגתי בצפיפות איזופיקנית

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

בידוד גרעינים לריצוף מולטיומי בדגימת גידול מוצק

Optimized Nuclei Isolation from Fresh and Frozen Solid Tumor Specimens for Multiome Sequencing

Multiome sequencing, which provides same-cell/paired single-cell RNA- and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) data, represents a breakthrough in our ability to discern tumor cell heterogeneity-a primary focus of translational cancer research at this time. However, the quality of sequencing data acquired using this advanced modality is highly dependent on the quality of the input material. 
Digestion conditions need to be optimized to maximize cell yield without sacrificing quality. This is particularly challenging in the context of solid tumors with dense desmoplastic matrices that must be gently broken down for cell release. Freshly isolated cells from solid tumor tissue are more fragile than those isolated from cell lines. Additionally, as the cell types isolated are heterogeneous, conditions should be selected to support the total cell population. 
Finally, nuclear isolation conditions must be optimized based on these qualities in terms of lysis times and reagent types/ratios. In this article, we describe our experience with nuclear isolation for the 10x Genomics multiome sequencing platform from solid tumor specimens. We provide recommendations for tissue digestion, storage of single-cell suspensions (if desired), and nuclear isolation and assessment.

מחבר זרקור: שיפור בידוד גרעינים לריצוף מולטיומי במיקרו-סביבות גידול מאתגרות

The protocol provides a reliable and optimized approach to the isolation of nuclei from solid tumor specimens for multiome sequencing using the 10x Genomics platform, including recommendations for tissue dissociation conditions, cryopreservation of single-cell suspensions, and assessment of isolated nuclei.

בידוד גרעינים אופטימלי מדגימות גידול מוצק טרי וקפוא לריצוף מולטיומי

Multiome sequencing, which provides same-cell/paired single-cell RNA- and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

ב ההיפוך חלוקה subcellular באתרו של בתאי יונקים חסיד שאינן חסיד

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Biology

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

אופטימיזציה של לכידת לייזר Microdissection עבור בידודו של הגרעינים המעית מרקמות אנושיות מוקפאות

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Neuroscience

<meta charset="utf8"></head><body>מודל מורין לחקר אילאוס לאחר הניתוח באמצעות מניפולציה במעיים

Postoperative Ileus Murine Model

Most patients experience postoperative ileus (POI) after surgery, which is associated with increased morbidity, mortality, and hospitalization time. POI is a consequence of mechanical damage during surgery, resulting in disruption of motility in the gastrointestinal tract. The mechanisms of POI are related to aberrant neuronal sensitivity, impaired epithelial barrier function, and increased local inflammation. However, the details remain enigmatic. Therefore, experimental murine models are crucial for elucidating the pathophysiology and mechanism of POI injury and for the development of novel therapies.
Here, we introduce a murine model of POI generated via intestinal manipulation (IM) that is similar to clinical surgery; this is achieved by mechanical damage to the small intestine by massaging the abdomen 1-3 times with a cotton swab. IM delayed gastrointestinal transit 24 h after surgery, as assessed by FITC-dextran gavage and fluorescence detection of the segmental digestive tract. Moreover, tissue swelling of the submucosa and immune cell infiltration were investigated by hematoxylin and eosin staining and flow cytometry. Proper pressure of the IM and a hyperemic effect on the intestine are critical for the procedure. This murine model of POI can be utilized to study the mechanisms of intestinal damage and recovery after abdominal surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>מודל Ileus Murine לאחר הניתוח

We describe a murine model of postoperative ileus generated via intestinal manipulation. Gastrointestinal transit function, pathologic changes, and immune cell activation were assessed 24 h after surgery.

מודל Ileus Murine לאחר הניתוח

Most patients experience postoperative ileus (POI) after surgery, which is associated with increased morbidity, mortality, and hospitalization time. POI ...

Fractionation subcellular של דגימות מדרכי העיכול טריים וקפואים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד של פיברובלסטים / myofibroblasts 90 + CD מאדם דוגמאות במערכת העיכול קפוא

תא Fractionation של תאים U937, בהעדר צנטריפוגה במהירות גבוהה

בידוד גרעינים מגידולים טריים במוח קפוא ל-RNA-seq חד-גרעיני ו-ATAC-seq

פיצול תאים של תאי U937 על ידי טיהור הדרגתי בצפיפות איזופיקנית

בידוד גרעינים אופטימלי מדגימות גידול מוצק טרי וקפוא לריצוף מולטיומי

בידוד גרעינים אופטימלי מדגימות גידול מוצק טרי וקפוא לריצוף מולטיומי

בידוד גרעינים אופטימלי מדגימות גידול מוצק טרי וקפוא לריצוף מולטיומי

ב ההיפוך חלוקה subcellular באתרו של בתאי יונקים חסיד שאינן חסיד

אופטימיזציה של לכידת לייזר Microdissection עבור בידודו של הגרעינים המעית מרקמות אנושיות מוקפאות

מודל Ileus Murine לאחר הניתוח