עבודה זו מומן על ידי גרנט NIGMS P50GM107618. המחברים תודה זהר B. וינשטיין להערות תובנה של הצעות על כתב היד.

הערה: כל מולקולה קטנה זה מעכב התפתחות חיידקים e. coli יכול לשמש עבור שיטת אלכסוני. ב פרוטוקול זה, levofloxacin (לב), חומצה nalidixic (NAL), ו פניצילין G (PNG) ישמש כדוגמה, מאז תרופות אלה להראות סינרגיה משולשת מובהקת. זרימת העבודה של פרוטוקול זה מוצג באיור 6. לבצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר. השתמש aliquots טריים של חיידקים, תרופות כל יום. לבצע את הניסוי תחת רמות אבטחה מתאים e. coli.
1. הכנה צעדים
<ol><li>להכין לוריא-Bertani (LB) מדיה על-ידי הוספת 25 גר' מרק LB 1 ליטר של מים מזוקקים ומערבבים. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות וחנות המדיה בלוק בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הכן e. coli גליצרול מניות על ידי ערבוב נפחים שווים של גליצרול 50% סטרילי, תאים חיידקיים מדולל כדי OD600 = 1 LB מרק ומקפיאים 150 aliquots µL 1.5 mL צינורות microcentrifuge ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לפזר 20 מ ג של אנטיביוטיקה, לב, NAL ו- PNG ב- 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) כל אחד. לדלל לב פתרון 100 x 0.2 µg/mL על ידי ערבוב µL 10 של פתרון לב עם 990 µL של דימתיל סולפוקסיד. השתמש 0.2 מ"ג/מ"ל לב, 20 מ"ג/מ"ל NAL ו- PNG בשלבים בהליך.</li>
	<li>Aliquot 50 µL של כל אנטיביוטיקה ל 1.5 mL microcentrifuge צינורות, הקפאת ב-20 ° C.</li>
	<li>Aliquot µL לקחת 150 אחד של e. coli מ-80 מעלות צלזיוס. הפשרה.</li>
	<li>להוסיף 100 µL של e. coli גליצרול מניות ב 5 מ ל LB מדיה בשפופרת תרבות 14 מ.</li>
	<li>לרעוד הצינורות 37 ° C חממה בן לילה-200 סל ד.</li>
</ol>2. טורי דילול ניסוי מנה-תגובה
<ol><li>קח את אחד aliquot של סמים לב, NAL ו- PNG מ-20 ° C, להשאיר אותם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. להפשיר ולהתכונן דילולים טורי של תרופות אלו.</li>
	<li>להכין 1100 µL של סול LB - 10% על ידי ערבוב 990 µL של התקשורת LB µL 110 של הממס (דימתיל סולפוקסיד).</li>
	<li>להכין µL 500 של לב LB - 10% על ידי ערבוב µL 450 של מדיה LB µL 50 של לב.</li>
	<li>מערבולת סול LB - 10% עבור 5 s ב ההגדרה הגבוהה ביותר. הוסף 20 µL של סול LB - 10% העליון ארבע השורות של בורות מים microplate 96-ובכן.</li>
	<li>מערבולת לב LB - 10% עבור 5 s ב ההגדרה הגבוהה ביותר. להוסיף 20 µL של LB - 10% לב הבאר הראשונה בשורה א</li>
	<li>היכונו דילול טורי כפולה לב LB - 10% על ידי לקיחת 20 µL מן הבאר הראשונה, הוספת הבאר השנייה, pipetting לאורך חמש פעמים. חזור על הפעולה עבור כל בארות ברצף עד ה-11 טוב, אשר בסופו עם 40 µL (איור 7 א).</li>
	<li>להסיר ולמחוק 20 µL של התוכן של ה-11, שימוש של micropipette.</li>
	<li>חזור על הצעדים 2.3-2.7 הסמים NAL ו- PNG באמצעות לשורות microplate, השני והשלישי בהתאמה.</li>
	<li>חזור על הצעדים 2.3-2.7 התרופה לב שוב על השורה הרביעית כפקד של חיובי פנימי.</li>
	<li>שימוש ספקטרופוטומטרים, למדוד את יתר600 של 1:10 דילול של התרבות (שלבים 1.5-1.7).</li>
	<li>לדלל את התאים ב 5 מ של מדיה ליברות יתר600 של 0.01. שופכים לתוך מאגר.</li>
	<li>שימוש של micropipette רב-ערוצי, להוסיף µL 80 של התאים מדולל דילולים טורי סמים מוכנה בשלב 2.4-2.9. ריכוז התרופה האחרונה היטב כל מוצג איור 7 א. חותם את הצלחת כדי למנוע התאיידות.</li>
	<li>דגירה את הצלחת. בשביל h 16 ב 37 º C.</li>
	<li>מתחילים תרבות חדשה חיידקי לשימוש בשלב 3 (חזור על צעדים 1.5-1.7).</li>
</ol>3. ליניארי דילול ניסוי מנה-תגובה
<ol><li>למדוד את ספיגת600 OD לצלחת מנה-תגובה דילול טורי משלב 2 שימוש בקורא צלחת (איור 7 א נכון) ולפרש את התוצאות בהתבסס על השלבים הבאים.</li>
	<li>לנרמל את הצמיחה על ידי חלוקת הגידול בכל טוב עם הגידול בפקד סמים אין עבור כל שורה ולחישוב אחוזי הצמיחה על ידי נרמול OD600למצב ללא סמים.</li>
	<li>לכל סם, אתר הבארות שיש עיכוב גדילה ~ 50% (IC50), שמוצג כתום איור 7 א נכון. הקצה את הריכוז בבארות האלה כמו "IC50 טורי" לכל סם.</li>
	<li>הפשרת סמים טרי aliquots, להכין 1 מ"ל של סול LB - 10% על ידי ערבוב LB ומדיה הממס (דימתיל סולפוקסיד) 9:1 יחס, סמים LB - 10% על ידי ערבוב LB ומדיה סמים על יחס 9:1, הריכוז של התרופה איפה x 100 של IC50 סדרתי של כל תרופה לפני הוספת התקשורת ליברות , כפי שבחרת בשלב 3.3.</li>
	<li>להכין מנות באופן ליניארי הגוברת של סמים לב, NAL ו- PNG בריכוזים 11, על ידי ערבוב LB - 10% sol כרכים שמוצג באיור 7 בוהסמים LB - 10%.</li>
	<li>להכין מנות באופן ליניארי הגוברת של לב על השורה הרביעית כפקד של חיובי פנימי.</li>
	<li>למדוד את יתר600 של ה-1:10 דילול של התרבות התחיל בשלב 2.14.</li>
	<li>לדלל את התאים ב 5 מ של מדיה ליברות יתר600 של 0.01. שופכים לתוך מאגר.</li>
	<li>מוסיפים 80 µL של התאים מדולל על דילולים ליניארי סמים מוכנה בשלב 3.6 באמצעות micropipette רב-ערוצי. ריכוז התרופה האחרונה היטב כל מוצג באיור 7. הערה: באמצע גם המנה-תגובה יקבלו את IC50 סדרתי של הסם. חותם צלחת כדי למנוע התאיידות.</li>
	<li>דגירה את הצלחת. בשביל h 16 ב 37 º C.</li>
	<li>התחל שתי תרבויות חיידקי טריים לשימוש בשלב 4 (חזור על צעדים 1.5-1.7).</li>
</ol>4. אלכסוני סמים אינטראקציה ניסוי
<ol><li>למדוד את ספיגת600 יתר על דילול ליניארי מנה-תגובה מ שלב 3 (איור 7 ב).</li>
	<li>לכל סם, לבחור הריכוז, גרמו IC50, להכין סמים לב, NAL ו- PNG בריכוזים x IC50 100.</li>
	<li>הפשרת סמים טריים, היכונו 100 x IC50 עבור כל הסמים ולהכין תערובות 1:1 סמים לפי נפח של לב + NAL, לב + PNG ו- NAL + PNG ו- 1:1:1 סמים תערובת לפי נפח של לב + NAL + PNG.</li>
	<li>להכין שתי צלחות לניסויים אינטראקציה סמים כמוצג באיור8.</li>
	<li>למדוד את יתר600 של ה-1:10 דילול של התרבויות התחיל בשלב 3.11.</li>
	<li>להכין OD600 = 0.01 דילולים של שתי תרבויות ב שני 10 מ ל LB מדיה.</li>
	<li>מוסיפים 80 µL של התאים מתרבות 1 ו- 2 על צלחות 1 ו- 2, בהתאמה. חותם את הצלחות כדי למנוע התאיידות. דגירה הלוחות עבור h 16 ב 37 º C.</li>
</ol>5. אלכסוני סמים אינטראקציה עם ציונים
<ol><li>למדוד ספיגת600 יתר לאינטראקציה סמים אלכסוני הניסוי צלחות משלב 4.</li>
	<li>לנרמל את הצמיחה על ידי חלוקת הגידול בכל טוב עם הגידול בפקד סמים לא טוב עבור כל שורה.</li>
	<li>עבור כל שורה, אתר את העמודה בעלת הצמיחה עיכוב הקרוב ביותר IC50, שמוצג כתום באיור 8 צודק. הקצה IC50 מבוסס על הריכוז היחסי של סמים בתוך הבאר הזו.</li>
	<li>לב + NAL, לב + PNG של מינון-תגובות NAL + PNG ולב + NAL + PNG, לחשב IC50 הצפוי על ידי חישוב ממוצע של IC50 של התרופות יחיד בכל שילוב. שימו לב כי בממוצע הערכה פשוטה לחישוב IC50 הצפוי המדויק כפי שתואר לפני12.</li>
	<li>לחשב ריכוז מעכבות החלקי (FIC) ציונים על-ידי חלוקת את IC50 נצפתה על ידי IC50 הצפוי בכל שילוב.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-target+therapeutics:+when+the+whole+is+greater+than+the+sum+of+the+parts.">Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts.</a> Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?.">What is synergy?.</a> Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).</li><li>Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+and+their+interactions.">Drugs and their interactions.</a> Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).</li><li>Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. P., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+interactions+and+the+evolution+of+antibiotic+resistance.">Drug interactions and the evolution of antibiotic resistance.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (6), 460-466 (2009).</li><li>Leh&#225;r, J., Krueger, A., Zimmermann, G., Borisy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+combination+effects+and+biological+robustness.">High-order combination effects and biological robustness.</a> Molecular Systems Biology. 4 (1), 215 (2008).</li><li>Loewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+problem+of+synergism+and+antagonism+of+combined+drugs.">The problem of synergism and antagonism of combined drugs.</a> Arzneimittelforschung. 3 (6), 285-290 (1953).</li><li>Foucquier, J., Guedj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+drug+combinations:+current+methodological+landscape.">Analysis of drug combinations: current methodological landscape.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 3 (3), (2015).</li><li>Wood, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pairwise+interactions+and+the+battle+against+combinatorics+in+multidrug+therapies.">Pairwise interactions and the battle against combinatorics in multidrug therapies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (37), 10231-10233 (2016).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+testing+for+synergy+with+any+number+of+agents.">A method for testing for synergy with any number of agents.</a> Journal of Infectious Diseases. 137 (2), 122-130 (1978).</li><li>Weinstein, Z. B., Zaman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioassay+to+identify+antimicrobial+drugs+through+drug+interaction+fingerprint+analysis.">Quantitative bioassay to identify antimicrobial drugs through drug interaction fingerprint analysis.</a> Scientific Reports. 7, 42644 (2017).</li><li>Horn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+drug+combinations+are+required+to+effectively+kill+colorectal+cancer+cells.">High-order drug combinations are required to effectively kill colorectal cancer cells.</a> Cancer Research. 76 (23), 6950-6963 (2016).</li><li>Cokol, M., Kuru, N., Bicak, E., Larkins-Ford, J., Aldridge, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+and+factorization+of+high-order+drug+interactions+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis.</a> Science Advances. 3 (10), e1701881 (2017).</li><li>Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies.">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Molecular Systems Biology. 12 (5), 872 (2016).</li><li>Mason, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+antibiotic+interactions+using+descriptors+derived+from+molecular+structure.">Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).</li><li>Yilancioglu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-independent+prediction+of+drug+synergies+using+only+drug+lipophilicity.">Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).</li><li>Beppler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+emergent+interactions+in+three-way+combinations+of+stressors.">Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800 (2016).</li><li>Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+identification+of+synergistic+and+antagonistic+emergent+interactions+among+three+or+more+drugs.">Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs.</a> Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

השימוש של שילובים תרופתיים נגד פתוגנים או גידולים הוא פרוספקט אטרקטיבי, במיוחד בנסיבות של הצינור לאנטיביוטיקה ייבוש. עם זאת, פוטנציאל זה היא הקשו על ידי לפחות שני קשיים. הקושי הראשון הוא מספר אסטרונומי של צירופים אפשריים. לדוגמה, ישנם 4950 pairwise. צירופים אפשריים בין 100 אנטיביוטיקה. כל השילובים האפשריים בין 100 אנטיביוטיקה (2100) נמצא באותו סדר גודל הצפוי עם המספר של חיידקים על פני כדור הארץ (~ 1030). כיצד לחזות שילובים חריפה סינרגטי בין האפשרויות הללו כבר את הנושא של מחקרים רבים חישובית. הקושי השני הוא המדד של אינטראקציות בסמים גבוהים. קח בחשבון כי פלטפורמה חישובית יכול להציע כי שילוב 10-סמים מסוימים הוא סינרגטי בחריפות נגד חיידקים מסוימים. שיטות מסורתיות כדי לבדוק אינטראקציות בסמים הוא יקר מדי לאמת או להפריך השערה זו, ולכן המחקר של סינרגיה בין תרופות רבות כבר מחוץ לגבולות של חקירה מדעית. שיטת אלכסוני, אשר הועלתה לראשונה לפני כמעט 30 שנה והיה בשימוש מספר מסכי סינרגיה האחרונה מספקים בסיס חזק הבעיה הראשונה, בכך שהוא מאפשר בדיקה של האינטראקציה בין זוגות רבים. הוא פותר את הבעיה השנייה על ידי הדגימה אינפורמטיבי של מבחני המסורתי ומאפשר לימוד גבוהים תרופתיות.
חשוב לציין נציין כי הפרוטוקול שלנו משתמשת מינון לינאריים למדידות אינטראקציה עם סמים, כדי לספק את הרגישות לגילוי אפילו אינטראקציות חלשות. הקמת טווח ריכוז נכון עבור מינון לינאריים הוא משימה מאתגרת. מאת הראשון מבצע לדילול טורי, לנו לקבל החלטה מושכלת לגבי שטח החיפוש עבור מינון לינאריים. עם זאת, הפרוטוקול יכול להיות שונה לשימוש קיפול כפול או דילולים טורי גבוה יותר עבור סמים בדיקות האינטראקציה. שינוי כזה לקצר את זמן הניסוי ולאפשר בדיקה של אינטראקציות יותר; ואולם זה אין רגישות כדי לזהות אינטראקציות רק בחום סינרגטי או עוינת.
פרוטוקול שהסברנו מציג את המדידה של אינטראקציות pairwise או משולשת. היבט חשוב של הפרוטוקול הוא אחד הסוכנים באותה צלחת כמו השילוב, כדי לצמצם הטיה בשל הבדלים צלחת. לכן, ניתן להתאים את הפרוטוקול כדי למדוד את האינטראקציות עד 7-הדרך שילובים על-ידי שינויים טריוויאלי. שילובים של תרופות יותר מ-7 ידרוש יותר מפעם אחת microplate 96-ובכן, שיקולים נוספים יש לנקוט כדי להבטיח שילוב הנתונים הנכונים, כגון משכפל הבין-plate.
מגבלה הבולטים של השיטה אלכסונית היא ההגבלה כי כל תרופה וזמינותו חייב לעכב את פנוטיפ של עניין. לכן, השיטה אלכסוני אינו שימושי להבנת את האינטראקציות בין סוכנים פעילים וחיסונים adjuvants אינרטי. אינטראקציות 'שמגדיל יכולתו' כזה עשויים להילמד תחת מודלים חלופיים כגון מודלים אושר או סוכן יחיד הגבוהה ביותר.
שיקול חשוב לניתוח של אינטראקציות בסמים גבוהים הוא הבחירה null מודל "מצופה IC50." כאשר שתי תרופות משולבות, האפקט של השילוב בלבד ניתן להשוות את ההשפעות התרופה יחיד. כאשר שלושת התרופות משולבות, ניתן להשוות האפקט של השילוב אפקטים בודדים או אפקטים pairwise. לדוגמה, אם כל השילובים pairwise של שלושת התרופות סינרגטי, ואז זה יש לצפות כי תרופות אלו יראה סינרגיה-כיוונית. הסטייה של אינטראקציה משולשת מה צפוי של אינטראקציות pairwise לאחרונה שכונה "אינטראקציה מתהווים"16,17. פשטות, פרוטוקול שלנו מתאר את המדידה של 3 חלקים של שילוב "נטו אינטראקציה," אשר מגדיר את המודל null השפעות סמים בכול. עם זאת, הנתונים המתקבל מהגדרת הפרוטוקול עשוי לשמש גם כדי לחשב את האינטראקציה מתהווה של השילוב-כיוונית. בניתוח שלנו, אנו מגדירים את IC50 הצפויה של השילוב-כיוונית כממוצע של הסם יחיד IC50s. לחלופין, IC50 צפויה יכולה להיות מוגדרת כממוצע של IC50s של שילובים pairwise (~1.1-1.2). כאשר IC50 נצפתה מחולק ב- IC50 הצפוי חלופית זו, FIC שהושג מספק את FIC מתהווים השילוב-כיוונית, כמו שתואר לעיל12. שיקול זה מגלה כי לב + NAL + PNG הוא סינרגטי יותר מאשר מה מצופה מכל האינטראקציות pairwise בין שלושת התרופות, הוכחת כי לב + NAL + PNG יש סינרגיה מתהווה.

שילובים תרופתיים ייתכן שיישומים השפעה מפתיעה גבוה או נמוך על הפנוטיפ נתון להשפעות של סמים המרכיבים אותה, המתאים סינרגטי או אויבת תרופתיות, בהתאמה1,2,3. השימוש של שילוב סינרגטי עשוי לאפשר המינון להגדלת היעילות וצמצום במינון להקלה לוואי. שילוב הטיפולים עשוי לחול גם עיכובים מרובים למכונאות הסלולר, ובכך חוסם מנגנוני הבריחה אבולוציונית פוטנציאל ההתנגדות4. לכן, שילובים של שלושה או יותר תרופות משמשים באופן שגרתי פתוגן או סרטן הטיפול5.
סינרגיה, אנטגוניזם מוגדרים על-ידי השוואה בין השפעת שילוב לעומת אפקט הצפויה בהתחשב סמים בודדים תופעות שנצפו. בין המודלים תרופתיות, לואי additivity היא המחמירה והקפדנית ביותר יש מודל null מוגדרים היטב (איור 1)6ואת האינטראקציה סינרגיה הנגזרת/אנטגוניזם אינו תלוי ריכוז התרופה בשימוש 6 , 7. לעומת זאת, המודל Loewe היא השפעול יקר אפילו עבור מבחן pairwise אינטראקציה. מבחני אינטראקציה סמים באופן מסורתי המרכיבים של מטריצה דו-ממדית של שילובים תרופתיים ריכוז (וזמינותו לוח שחמט) (איור 2). 5 מנות משמשים עבור כל סם, אם 25 שילובים נדרשים, התואם לאחד מחצית microplate אם מתבצעות בשכפול. העלות של גישה זו אוסרת על סינרגיה מדידה לפי מודל additivity Loewe עבור שילובי סמים רב (איור 3). לדוגמה, כדי לבדוק את האינטראקציה של 10-way, שיטות מסורתיות ידרוש יותר מ 100 אלף microplates, ולסיסמא מדידה ניסיוני של סינרגיה גבוהה-הזמנה לפי מודל additivity Loewe מחמירים, theorized היטב, שאינו תלוי-ריכוז 8.
טיפולים קליניים שוטפים מנצלים רק שבריר של שילובים תרופתיים אפשרי. לדוגמה, הטיפול הסטנדרטי של שחפת פעילה הוא שילוב של שלושה אנטיביוטיקה. ישנם כ 20 אנטיביוטיקה המשמשים לטיפול שחפת Mycobacterium (שחרור מהיר למוט אוכף). ישנם 1140 הקומבינציות אסידו בין 20 תרופות, כל אחד עם פוטנציאל יש סינרגיה חזקה נגד שחרור מהיר למוט אוכף. שם כבר אין שיטה חסכונית כדי למדוד את תגובות בין תרופתיות בין תרופות רבות, הצלת חיים פוטנציאל סינרגטי שילובים נשארים שלא נבדקו.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול פשוט למדוד pairwise וכיוונית תרופתיות באמצעות דגימת רק באלכסון של וזמינותו לוח שחמט (איור 4 , איור 5). הרעיון הבסיסי של דגימה האלכסון של ניסוי לוח שחמט היתה תיאוריה על-ידי Berenbaum בעבודתו החלוצי ב 19789. ובכל זאת, גישה זו רק לאחרונה הוחל סמים סינרגיה מסכי10,11,12. אנו מציגים את הפרוטוקול שלנו עם Escherichia coli (e. coli) ותפקיד של צמיחה. עם זאת, נציין כי הפרוטוקול עצמאי של מינים ביולוגיים, פנוטיפ של עניין, ולכן ניתן להחיל את המידה של סמים גבוהים סינרגיה בהקשרים ביולוגיים אחרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="528">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1.5 mL Semi Micro Cuvette&#160;</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97000-586</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">1.5 mL &#160;Eppendorf&#160;Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:125px;">USA Scientific</td>
			<td>4036-3204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1000 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">14 mL Breathable Cell Culture Tube</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>60819-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Panasonic</td>
			<td>MIR-262-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Shaker Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL Cell Culture Serological Pipette</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>53300-421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Microplates</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breathable Sealing Film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2920-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">DMSO</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>41647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:125px;">ATCC</td>
			<td>700926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">LB Broth Powder</td>
			<td style="width:125px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">L24065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">28266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette</td>
			<td style="width:125px;">GILSON</td>
			<td style="width:119px;">PIPETMAN Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:125px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multichannel micropipette</td>
			<td style="width:125px;">VistaLab</td>
			<td style="width:119px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Nalidixic acid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N8878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Penicillin G</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Pump</td>
			<td>Drummond&#160;</td>
			<td>4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent Reservoir</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>89094-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:125px;">BIO-RAD</td>
			<td>1702525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-320-807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diagonal method to measure synergy among any number of drugs

שילוב סינרגטי סמים יש על יעילות גבוהה יותר בהשוואה להשפעות של סמים בודדים. מבחני לוח שחמט, איפה הסמים משולבים במינונים רבים מאפשרים מדידה רגיש של תגובות בין תרופתיות. עם זאת, מבחני האלה יקרות, אל תגדיל גם עבור מדידת אינטראקציה בין תרופות רבות. מספר מחקרים שנערכו לאחרונה דיווחו על סמים אינטראקציה מדידות באמצעות דגימה אלכסוני של לוח שחמט מסורתי וזמינותו. מתודולוגיה חלופית זו במידה רבה מקטין את העלות של סמים אינטראקציה ניסויים ומאפשר אינטראקציה המדידה שילובים עם תרופות רבות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי למדוד את האינטראקציות pairwise שלושה, אחד אינטראקציה משולשת בין שלושה אנטיביוטיקה על כפולות, תוך חמישה ימים, תוך שימוש רק שלושה microplates 96-ובכן וציוד מעבדה סטנדרטיים. אנו מציגים תוצאות נציג מראה כי שילוב שלוש-אנטיביוטיקה Levofloxacin + חומצה Nalidixic + פניצילין G הוא סינרגטי. פרוטוקול שלנו להרחבה מדרגית כדי למדוד אינטראקציות בין תרופות רבות, בהקשרים אחרים ביולוגי, המאפשרות מסכי יעיל עבור סינרגיה סמים רב נגד פתוגנים וגידולים.

בעבר דיווחנו את האינטראקציות pairwise בין שלושה סוגי סמים: לב, NAL ו- PNG מבוסס על בדיקות מבחני ולמחקר לוח שחמט, שבו שתי התרופות היו בשילוב13,מטריצה 4 x 414. בעוד NAL ולא לב היו סינרגטי, PNG דווח להיות עוינת עם13,לב והן NAL14. כאן, אנחנו אומת אינטראקציות pairwise אלה נמדד אינטראקציה משולשת בין תרופות אלו שלושה שימוש assay אלכסוני של. התוצאות שלנו להפגין כי לב + NAL + PNG היא שילוב סינרגטי של אנטיביוטיקה 3-way. ייצוג סכמטי עבור התוצאות של סעיפים בודדים ניתוח ניסיוני ניתנו בצד ימין של איור 7 ו איור 8. כאן, אנו מציגים לפרש תוצאות raw נציג שלוש קריאות צלחת, הניתנות באיור9. הקריאה הפלטה מקביל דילול טורי וארוך ניסויים שנערכו שלבים 2 ו- 3. התחתון שני בצלחת הקריאות צלחות אינטראקציה כפולים שנערך בשלב 4.
הנתונים הגולמיים באיור 9 מראה כי הצמיחה העליונה היא סביב 0.55, אבל יש צפיפות אופטית 0.05 של התקשורת עצמה, כפי שנצפתה ה OD600 של ריכוז גבוה סמים שבה אין צמיחה. לכן, אנו מגדירים IC50 כמו (0.55-0.05)/2 = 0.25. עבור כל מנה-תגובה, הבארות ממוקם קרוב לערך זה מוצגים עם כתום.
החצי העליון של איור 9A מציגה את התוצאות של שלב 2, טורי מנה-תגובה ניסוי. בארות IC50 לב הוא עמודה 10 עובדים בשני משכפל, אשר תואמות את 4 ng/mL. IC50 עבור NAL ו- PNG נמצאים 3 µg/mL 25 µg/mL, בהתאמה. ריכוזים אלה תואמים ריכוז 1 x שמוצג באיור 7. החצי התחתון של איור 9B מציגה את התוצאות של שלב 3, ניסויים של מנה-תגובה לינארית. לב, NAL, IC50 של PNG נמצאים 0.4 x, 0.8 x ו- 1.2 x, בהתאמה. ריכוזים אלה מוקצות כמו ה 1 X IC50 שלב 4.
שתי צלחות המתאים שכפול שני ניסויים מוצגות באיור איור 9B, איפה IC50 בארות מוצגים עם כתום. בצלחת 1, כל התרופות יחיד יש IC50 שלהם 1 x ריכוז. IC50 הצפוי עבור שילוב pairwise או משולשת מחושב לפי הממוצע החשבוני של סמים המרכיבים אותה, שהופך IC50 הצפוי עבור כל שילובי גם 1 x ריכוז. בצלחת 2, לב ו- PNG יש IC50 שלהם-ריכוז 1 x, אך NAL IC50 ב 1.2 x. IC50 הצפוי עבור כל שילוב מוגדר באמצעות אמצעי האריתמטיקה של ערכים אלה IC50. לדוגמה, IC50 הצפוי עבור לב + NAL ו- NAL + PNG היא 1.1 x. האינטראקציה סמים ניקוד (FIC) עבור כל צירוף הוא מחושב על ידי חלוקת נצפתה IC50 עם IC50 הצפוי, כפי שמוצג על הצד הימני של הלוחות. בדיקה של עשרות FIC שתי צלחות מדגים לב + NAL ולא לב + NAL + PNG הם סינרגטי, ואילו לב + PNG ו- NAL + PNG הם אויבת. FIC ציוניהם ב שתי צלחות הם מסכימים, המשנה את המהימנות של הפרוטוקול.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig1.jpg"> איור 1: Null ההגדרה המודל עבור לואי additivity סמים אינטראקציה דגם- 5 x 5 שתי מטריצות על microplate, שבו סמים A באופן ליניארי גדל בציר אחד כפי שמוצג בחלק השמאלי, ריכוז העליון של התרופה מעכב הפנוטיפ לכימות (למעלה מימין). התוספת של מטריצות אלה מוצג באמצע, שבו הקווים המחברים equipotent סמים ריכוזים של כל תרופה יחידה יש ריכוז זהה כמו סמים א כאשר תאים נוספים על "בשביל" של שילובים תרופתיים ריכוז, צפוי כי פנוטיפ מוקלט על הקו הזה יהיה שווה בשביל הבארות שהיא מתחברת. בניסוי זה האינטראקציה האני-עצמי בסמים, isobole המתארים את הפנוטיפ (מוצג עם קו ירוק מקווקו) צפוי להיות ליניארי, הגדרת המודל additivity null. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57713/57713fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig2.jpg"> איור 2: תרופתיות Pairwise לפי מודל האינטראקציה של סמים additivity Loewe. כאשר שתי תרופות משולבות ב- assay לוח שחמט כמו באיור 1, קווי המתאר isophenotypic נצפתה עשוי להיות ישר, קמורה או קעורה. בצד ימין, קווי המתאר isophenotypic אפשרי (קווים ירוק מקווקו) הם יונחו על מבחני לוח שחמט. שילובים תרופתיים עם קווי מתאר isophenotypic ישר הן לאו-תוסף, קווי המתאר אינם שונים בכשל תרופתי האני-עצמי, אשר הוא לואי-תוסף לפי ההגדרה. כאשר קווי המתאר isophenotypic באופן משמעותי קעורים או קמורים, השילוב הוא סינרגטי או עוינת, בהתאמה. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57713/57713fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig3.jpg"> איור 3: 3 חלקים תרופתיות לפי מודל האינטראקציה של סמים additivity Loewe. בדומה וזמינותו לוח שחמט עבור אינטראקציות pairwise, שלוש-סמים משולבים ברשת תלת-ממד ("checkercube"), שבו כל תרופה הוא גדל באופן ליניארי בציר אחד. אם הסמים שלושה היו זהים, פני השטח isophenotypic צפוי להיות שטוח, מגדיר את additivity עבור שלושה שילובים תרופתיים. אם השטח יותר קעורים או קמורים יותר מודל null זה לאו-תוסף, שילובים תרופתיים הם סינרגטי או עוינת, בהתאמה. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57713/57713fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig4.jpg"> איור 4: שיטת באלכסון כדי למדוד תרופתיות pairwise. עבור כל לוח שחמט assay, נמדדים רק את האזורים המוצגים מלבנים בצבע ארגמן. i ו- ii הם ליניארי סמים בכול ריכוזים. השלישי הוא מוערך על ידי תערובת 1:1 של שתי תרופות ו באופן ליניארי titrating תערובת זו כאילו היא תרופה בודדת. FIC שווה IC50 נצפתה בשילוב מחולק את IC50 הצפויה של שתי תרופות יחיד. עבור המודל additivity לאו, IC50 הצפוי נאמדת באמצעות IC50 הממוצע של התרופות שני יחיד. ערך FIC 1 עבור זוגות לואי-תוסף והיא נמוכה או גבוהה מ- 1 עבור זוגות סינרגטי או עוינת, בהתאמה2,12. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57713/57713fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig5.jpg"> איור 5: שיטת באלכסון כדי למדוד-כיוונית תרופתיות. עבור כל checkercube assay, נמדדים רק את האזורים המוצגים. i, ii ו- iii נמצאים ליניארי סמים בכול ריכוזים. iv נמדד על ידי ביצוע של 1:1:1 תערובת של שלושת התרופות באופן ליניארי titrating תערובת זו כאילו היה תרופה בודדת. הריכוז המעכב החלקי שווה ה IC שנצפה50 בשילוב מחולק את IC50 הצפוי מקבלים שלוש תרופות יחיד. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57713/57713fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig6.jpg"> איור 6: זרימת עבודה עבור הפרוטוקול בשיטה אלכסונית המתוארים בזאת ואת פרטי ההתקנה עבור כל microplate. הצלחת באיור 4 יום מתבצע תוך שכפול. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57713/57713fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig7.jpg"> איור 7: דילול טורי וארוך מנה-תגובה ניסויים. (א) הכנה של דילול טורי מנה-תגובה סמים וריכוזי סמים הסופית המתאימה. E. coli תאים נוספים לצלחת; צמיחה נרשם לאחר ה 16 IC50 טורי, שמוצג כתום, נבחרה עבור כל סם טעם למחרת של ליניארי דילול מנה-תגובה ניסויים. (B) הכנה של דילול ליניארי מנה-תגובה סמים וריכוזי סמים הסופית המתאימה. E. coli תאים נוספים לצלחת; צמיחה נרשם לאחר 16 שעות. לכל סם, IC50s שנבחר אשר ישמש בליום סמים אינטראקציה ניסויים מוצגים ב orange. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57713/57713fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig8.jpg"> איור 8: סמים אינטראקציה ניסויים. הכנת ניסויים האינטראקציה הוא דומה יחיד סמים ליניארי מינון-תגובות, למעט 1:1 או 1:1:1 תערובת של תרופות משמש לשניים או שלוש תרופות במינון-תגובות, בהתאמה. נצפתה IC50s עבור כל מנה-תגובה, מתואר ב orange, משמשים לחישוב FIC ציונים. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57713/57713fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig9.jpg"> איור 9: נציג ניסוי תוצאות. נציג התוצאות המתקבלות באמצעות פרוטוקול המתואר מוצגים, עם פרטי ההתקשרות לטקסט הראשי. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57713/57713fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs at JoVE.com

Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

שיטת באלכסון כדי למדוד סינרגיה בין כל מספר של סמים

ב פרוטוקול זה, נתאר כיצד להפוך Loewe סמים additivity אינטראקציה מדידות של pairwise ואת שילובים תרופתיים-כיוונית.

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

diagonal-method-to-measure-synergy-among-any-number-of-drugs

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K Views.  Sabanci University. ב פרוטוקול זה, נתאר כיצד להפוך Loewe סמים additivity אינטראקציה מדידות של pairwise ואת שילובים תרופתיים-כיוונית.

Video: Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Assay ההתנהגות כדי למדוד את התגובה של דג הזברה לשינויים לעוצמות אור

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

מבחני photobleaching (FRAP &amp; FLIP) כדי למדוד Dynamics חלבון הכרומטין בתוך החיים בתאי גזע עובריים

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

הזרקת אינסולין ו Extraction Hemolymph כדי למדוד את הרגישות לאינסולין אצל מבוגרים תסיסנית melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

מערך השוואתי הגנום הכלאה (Array CGH) לאיתור של הגנום גרסאות מספר עותק

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

כמותי Immunofluorescence Assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בCentrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

באמצעות plusTipTracker תוכנה כדי למדוד microtubule Dynamics ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; קונוסים צמיחה

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

במבחנה Assay למדוד Phosphatidylethanolamine Methyltransferase פעילות

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

באמצעות מכשירים microfluidic למדוד פנוטיפים תוחלת החיים סלולר בתאי שמרים ניצני יחיד

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role in the body by controlling blood glucose levels through insulin secretion in response to elevated glucose concentrations. Insulin secretion is controlled by glucose metabolism and mitochondrial respiration. Therefore, measuring intact beta cell respiration is essential to be able to improve beta cell function as a treatment for diabetes. Using intact 832/13 INS-1 derived beta cells we can measure the effect of increasing glucose concentration on cellular respiration. This protocol allows us to measure beta cell respiration in the presence or absence of various compounds, allowing one to determine the effect of given compounds on intact cell respiration. Here we demonstrate the effect of two naturally occurring compounds, monomeric epicatechin and curcumin, on beta cell respiration under the presence of low (2.5 mM) or high glucose (16.7 mM) conditions. This technique can be used to determine the effect of various compounds on intact beta cell respiration in the presence of differing glucose concentrations.

The goal of this protocol is to measure the effect of glucose-mediated changes to mitochondrial respiration in the presence of natural compounds on intact 832/13 beta cells using high-resolution respirometry.

Respirometry ברזולוציה גבוהה כדי למדוד את הפונקציה מיטוכונדריאלי של תאי הבטא תקין בנוכחות תרכובות טבעיות

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

Using a Thermal Camera to Measure Heat Loss Through Bird Feather Coats

Feathers are essential to insulation, and therefore to the cost of thermoregulation,&#160;in birds. There is robust literature on the energetic cost of thermoregulation in birds across a variety of ecological circumstances. However, few studies characterize the contribution of the feathers alone to thermoregulation. Several previous studies have established methods for measuring the insulation value of animal pelts, but they require destructive sampling methods that are problematic for birds, whose feathers are not distributed evenly across the skin. More information is needed about 1) how the contribution of feathers to thermoregulation varies both across and within species and 2) how feather coats may change over space and time. Reported here is a method for rapidly and directly measuring the thermal performance of feather coats and the skin using dried whole skin specimens, without the need to destroy the skin specimen. This method isolates and measures the thermal gradient across a feather coat in a way that measurements of heat loss and metabolic cost in live birds, which use behavioral and physiological strategies to thermoregulate, cannot. The method employs a thermal camera, which allows the rapid collection of quantitative thermal data to measure heat loss from a stable source through the skin. This protocol can easily be applied to various research questions, is applicable to any avian taxa, and does not require destruction of the skin specimen. Finally, it will further the understanding of the importance of passive thermoregulation in birds by simplifying and accelerating the collection of quantitative data.

This protocol describes the quantification of heat transmission through a flat skinned avian specimen using a thermal camera and hot water bath. The method allows obtaining of quantitative, comparative data about the thermal performance of feather coats across species using dried flat skin specimens.

שימוש במצלמה תרמית למדידת אובדן חום באמצעות מעילי נוצות ציפורים

Feathers are essential to insulation, and therefore to the cost of thermoregulation,&#160;in birds. There is robust literature on the energetic cost of ...

שיטת באלכסון כדי למדוד סינרגיה בין כל מספר של סמים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video